新型N-磺酰基脒衍生物26ag抗结直肠癌作用及其机制的研究

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结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是最具有侵袭性的恶性肿瘤之一,发病率高,生存期短,恶性程度高,全球每年都有大量人口死于结直肠癌。在中国,结直肠癌的发病率也逐年升高,对我国人民的生命健康造成了严重威胁。由于结直肠癌具有高转移性、高复发率及易耐药等原因,总体治愈率较低。因此,开发有效、新颖、副作用少的药物对降低该疾病患者的病死率,提升患者生活质量具有重要意义。Wnt/β-catenin信号通路与结直肠癌的发展、侵袭转移以及较差的预后都密切相关。大量研究表明,Wnt/β-catenin信号通路可以促进细胞的上皮-间质转化(epithelial cell mesenchymal transition,EMT),增加肿瘤细胞的侵袭性及对凋亡的抵抗性。因此,靶向Wnt/β-catenin信号通路的药物有望成为治疗晚期转移性结直肠的一种有效的策略。胺类和磺酸盐因其在许多低毒性的选择性药物中的较好活性而受到广泛关注,磺胺脒有可能成为抗肿瘤药物的潜在的候选化合物。本课题中的化合物26ag是一种新型N-磺酰基脒衍生物,我们的前期研究证明其是一种C-Met抑制剂,但是否可以对结直肠癌具有治疗作用及其作用机制仍不清楚,因此,本课题围绕26ag抗结直肠癌的作用和机制展开研究。首先利用MTT实验检测26ag对不同人源结直肠癌细胞和人正常细胞的细胞毒性作用,结果表明26ag在体外能显著地抑制人结直肠癌细胞的增殖,其中对结直肠癌细胞HCT-116的抑制效果最为明显,而对于正常细胞的损伤较弱,因此我们选取HCT-116细胞进行后续相关的抗肿瘤机制的研究。采用DAPI、Annexin V/PI染色实验定性检测26ag对HCT-116细胞凋亡的影响,染色后,在镜下观察到HCT-116细胞表现出明显的发生细胞凋亡的特征与变化,同时Annexin V/PI的流式细胞分析实验也表明了凋亡细胞比例随着药物浓度的增加而升高。使用JC-1探针实验检测化合物26ag对结直肠癌细胞线粒体膜电位的变化情况,结果表明细胞线粒体膜电势呈剂量依赖性地逐渐降低。我们进一步通过Western blotting和qRT-PCR检测细胞凋亡相关蛋白的表达情况,发现26ag引起Cleaved Caspase-3、Bax的表达含量增加,引起Bcl-2的表达降低。通过qRT-PCR检测其mRNA水平,结果同样显示Bcl-2/Bax信号通路的激活,和蛋白表达趋势一致。进一步,为了确定26ag是否具有抑制结直肠癌细胞迁移的作用,我们通过伤痕愈合实验进行检测,结果表明化合物26ag处理后,HCT-116细胞的迁移能力显著下降。同时采用Transwell实验进一步验证化合物26ag抑制结直肠癌细胞HCT-116的侵袭和转移能力,结果显示化合物26ag能够呈剂量依赖性地降低HCT-116细胞侵袭和转移能力。通过Western blotting检测EMT相关蛋白的表达变化,再通过qRT-PCR检测其mRNA水平的变化。结果表明E-Cadherin表达趋势明显上升,N-Cadherin和Vimentin表达趋势显著下降。Western blot结果发现EMT核转录因子Snail和Slug表达也显著下调。最后,我们通过Western Blot实验,检测Wnt/β-catenin通路中蛋白分子的表达变化,结果表明Wnt/β-catenin通路中蛋白β-catenin、GSK-3β以及TCF4的表达显著降低。通过免疫荧光染色对β-catenin和GSK-3β进行分子定位,发现26ag不仅抑制β-catenin的表达,而且表现出明显地抑制β-catenin向核移位。通过计算机模拟对接软件预测化合物26ag与β-catenin结合的具体位点,表明26ag与β-catenin间有较强的分子间作用力且有合适的结合位点。综上所述,26ag可能作为Wnt/β-catenin信号通路的一种新型靶向抑制剂,抑制结直肠癌的增殖、侵袭及转移。化合物26ag作为治疗结直肠癌的潜在先导药物,值得进一步开发,为结直肠癌的治疗提供新的策略。
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