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大麦黄矮病毒(BYDV)是黄症病毒属(Luteovirus)的代表成员,其基因组为一条单链正义RNA分子。为深入认识BYDV与植物细胞互作的分子机制,本论文工作利用分子生物学手段,以过表达MP-GFP的拟南芥稳定株系为材料,研究BYDV-GAV株系MP(movement protein)蛋白对植物生长发育和细胞周期的影响。
在MP-GFP转基因植株中利用XVE诱导系统表达BYDV-GAV株系的MP蛋白,研究其在执行功能时的组织表达特异性及亚细胞分布。通过组织化学染色观察到MP基因主要在叶尖和根部表达,尤其是在根尖的表达量特别强;亚细胞定位结果显示在转基因植株的细胞中MP蛋白定位于细胞核核膜上。MP蛋白定位于核膜的特性可能有助于MP蛋白进入细胞核内,而MP基因主要在分生组织的表达模式也为它抑制植物的生长发育提供了基础。
利用XVE诱导表达系统在拟南芥中过量表达BYDV-GAV株系的MP基因,发现不论在整株水平还是在叶片或根的器官水平上,MP蛋白均能显著抑制拟南芥的生长发育,尤其对根的生长影响严重。进一步观察发现MP-GFP根尖分生区不仅长度变短,而且细胞数目明显少于野生型。随后对MP-GFP转基因植株根尖干细胞的活性进行了详细研究。在MP-GFP植株内QC(以QC25为代表)的活性显著下降,周围的干细胞活性也相继受到了抑制。此外淀粉粒的染色结果表明MP蛋白抑制了中柱干细胞的活性,使其处于分化状态,细胞分裂能力下降,最终导致淀粉粒含量明显降低。以上结果表明,BYDV-GAV株系MP蛋白可能通过抑制以QC为中心的干细胞,尤其是QC的活性,使分生区细胞的分裂能力下降,最终导致根的生长发育受到抑制。
利用流式细胞仪对MP-GFP植株的根和叶片DNA含量进行了多倍性分析,发现MP-GFP转基因植株叶片和根的多倍性程度都比WT明显加重,说明在MP-GFP植株内有丝分裂的过程受到了一定程度的抑制。为了进一步阐明BYDV-GAV株系MP蛋白对细胞周期的影响机理,在MP-GFP转基因植株内分析了不同细胞周期标记的表达情况。这些结果均表明MP蛋白抑制细胞周期在G2/M的顺利转变,而对G1/S转变几乎没有影响,即MP蛋白对细胞周期的作用时期是G2/M。
总之,通过研究BYDV-GAV株系MP蛋白对拟南芥生长发育及根尖干细胞活性的影响,从细胞水平上阐明了MP蛋白抑制植物生长发育的作用机理。流式细胞仪的DNA倍性分析以及细胞周期标记的表达分析表明BYDV-GAV株系MP蛋白抑制细胞周期在G2/M的顺利进行而对G1/S并无明显影响,这又从分子水平上初步阐明了MP蛋白对细胞周期的作用机理。