asb5是ASB家族的成员之一,可能与动脉闭塞性疾病的发生有关。本实验室前期研究发现asb5特异性地表达于人体的心脏和骨骼肌中,且在心脏中的表达较高,提示其可能与心脏和骨骼肌发育有关,但目前对asb5基因的生物学功能未知。斑马鱼作为模式生物具有多种优势,例如体外受精、胚胎透明、发育过程可在显微镜下进行观察、与人类基因组的同源性高达70%等。本研究以斑马鱼作为研究模型,构建斑马鱼asb5基因敲除品系,为后续研究asb5基因的功能提供基础。本研究通过跨越一个内含子分别在两个外显子上各设计一个打靶位,即双靶位点敲除的方式进行敲除工作。该方法相比于单个sgRNA介导的敲除,特异性更好,且能造成大片段的缺失,也易于后续的检测。首先,对asb5基因的基本生物学信息进行初步分析表明,人类ASB5基因在斑马鱼中的同源基因有asbaa和asb5b,本研究则是以asb5a基因作为研究对象。首先分别在该基因的2号和3号外显子上各设一个打靶位点,随后在体外合成sgRNA,将其与Cas9mRNA共同显微共注射到野生型斑马鱼一细胞期胚胎的细胞中。待胚胎发育至48小时后,进行打靶有效性分析,即选择一定数量的胚胎提取基因组,进行PCR扩增检测是否有突变条带的存在,保留打靶有效的胚胎,饲养至性成熟后,进行F0代突变体的筛选,即通过剪取尾鳍的方式提取基因组,经PCR扩增后将突变条带与pMD18-T载体连接,转化后提取质粒进行测序。序列比对结果表明F0代斑马鱼中有部分成鱼的asb5a基因出现大片段缺失。研究结果表明通过CRISPR/Cas9技术对asb5a基因的敲除能在斑马鱼体内造成有效的基因突变,这为后续的asb5a基因的功能研究提供了条件。