第一部分 TRDN和CALM1的多态性位点与慢性心力衰竭患者心源性猝死的相关性研究背景慢性心力衰竭(Chronic heart failure, CHF)因其较高的发病率、较差的预后和逐年增加的社会医疗负担等已成为当今世界的公共健康难题。尽管近年来医学界已在CHF的研究和治疗方面取得了很大进展,但其发病率和病死率仍然居高不下：国外报道患者五年死亡率约为50%,但我国尚缺乏CHF患者治疗现状及长期预后的前瞻性研究,未能对我国CHF患者进行综合评估。在CHF的死亡患者中,约半数死于恶性室性心律失常事件,即心源性猝死(Sudden cardiac death, SCD)。因此,对SCD进行预防和预警成为改善CHF预后的重要措施。研究发现有多种因素可提示CHF患者具有发生SCD的风险(包括心电学指标、血流动力学状态、生物学标记物和炎症因子等),但敏感性和稳定性欠佳,限制了其在临床的应用。目前认为,在普通人群中SCD是一种可以遗传的性状。SCD的发生大多是由于发生了致命性的心律失常,而钙离子循环在恶性心率失常的发生中起着十分重要的作用。不仅如此,近年来,有两项研究均发现了调控钙离子蛋白的单核苷酸多态性位点(SNP, Single nucleotide polymorphism)与SCD具有相关性。其中一项对心衰人群的研究发现钙离子释放通道的两个SNP位点(rs3766871和rs790896)与SCD的发生相关；另外一项研究则发现CASQ2的三个SNP位点(rs17500488、rs3010396和rs7366407)与SCD相关。目的本研究为大样本的前瞻性研究,目的在于发现钙调控蛋白上具有潜在功能的基因变异与SCD的相关性,探索钙调控蛋白的SNP位点与CHF患者预后的关系,从而确定CHF患者中致SCD的遗传学标记物。材料与方法入选对象为：从2005年至2009年1月就诊于阜外心血管病医院的慢性心力衰竭患者。入选标准包括：由于冠状动脉粥样硬化性心脏病导致的慢性心力衰竭,左心室射血分数≤50%；由于扩张性心肌病导致的慢性心力衰竭,左心室射血分数≤45%；纽约心功能分级为Ⅱ-Ⅳ级。门诊和电话随访慢性心力衰竭患者的死亡和猝死终点。采用候选基因策略分析20个多态性位点与心源性猝死的关系,采用质谱的方法进行基因分型,采用多元线性回归、Cox风险比例模型分析基因型对生存状况的影响,最后采用log-rank检验分析基因型与终点事件的关联。结果最终入选了1429个慢性心力衰竭病人,研究了十个钙离子调控蛋白基因的20个多态性位点与心源性猝死以及全因死亡的关系。我们的中位随访时间为63个月,其中538个(37.65%)病人死亡,这些人中有185个人死于心源性猝死,其他为非心源性猝死。P值小于0.0025认为显著相关。结果发现CALM1上的多态性位点rs3814843的CC基因型会显著增加心源性猝死的风险(HR 5.542,95% CI 2.054-14.948, P=.001)以及全因死亡的风险(HR 3.484,95% CI 1.651-7.350, P=.001)。调整了猝死相关的危险因素后,rs3814843仍与心源性猝死以及全因死亡显著相关,不仅如此,TRDN基因多态性位点rs361508的G等位基因也会显著增加慢性心力衰竭患者心源性猝死的风险。结论CALM1的多态性位点rs3814843与SCD的发生密切相关,此位点还与全因死亡相关。不仅如此,TRDN上的多态性位点亦rs361508与慢性心力衰竭患者SCD的发生显著相关,我们的工作为全面了解心源性猝死的发生机制提供了新的参考。第二部分 LMNA基因的错意突变（445V>E）与心肌致密化不全的相关性研究背景心肌致密化不全(LVNC, Left Ventricular Noncompaction)以心内膜海绵状结构形成为特点,这一海绵状结构是由心肌纤维交织成网状结构所形成,与正常致密的心室肌有区别显著。尽管心肌致密化不全发生的原因尚未明确,目前认为家族性心肌致密化不全的发生与基因突变有关。前期的研究发现多个基因(MYH7, ACTC, TNNT2, MYBPC3, LMNA, TAZ, DTNA, SNTA1等)的多个突变位点与心肌致密化不全的发生有关,其中包括核纤层蛋白的两个突变位点。核纤层蛋白基因(LMNA)位于1号染色体长臂,通过选择性剪接,LMNA编码两个蛋白：A型核纤层蛋白和C型核纤层蛋白(lamin　A/C)。这两个蛋白仅在羧基端存在的差异,二者均是V型中间丝蛋白,其结构包括氨基端的头部、α螺旋形成的杆状结构和一个位于羧基端的长尾巴结构,这个尾巴结构包括一个保守的球状结构域形成的免疫球蛋白(Ig, Immunoglobulin)样折叠。这一Ig样折叠包括九个p片层,这些p片层形成经典的p三明治结构。Ig样折叠有多种配体,包括DNA和细胞核内的蛋白,如片层连接蛋白2和emerin。A型和C型核纤层蛋白均是细胞核的组分,并参与形成细胞核内膜和核纤层,核纤层蛋白与细胞核的稳定作用是核膜力学完整性的物质基础。核纤层蛋白基因突变还与多种疾病表型有关,这些疾病包括：E-D氏肌营养不良(EDMD)、肢带肌营养不良症(LGMD)、扩张性心肌病和家族型部分脂肪代谢障碍(FPLD)。前期的研究结果也表明核纤层蛋白的突变会导致恶性心律失常及心源性猝死的发生。尽管植入式除颤器(ICD, implantable cardioverter defibrillator)的预防性应用可以挽救病人的生命,但是核纤层蛋白的突变与致命性心律失常的发生之间的关系目前尚未明确。目的在临床工作中,我们发现了一个心肌致密化不全的家系,先证者多次发生室速及室颤,并有家族猝死史,并发现其核纤层蛋白第445位氨基酸存在一个错义第二部分LMNA基因的错义突变(445 V>E)与心肌致密化不全的相关性研究突变,为了深入研究此突变所导致的功能及结构影响,并揭示此突变位点与猝死之间的关系,我们进行了本研究。方法从病人外周血白细胞中提取其基因组DNA,并通过一代测序的方法对其DNA进行检测,以发现基因突变位点。随后将突变及野生型基因连接到载体上,野生型或突变型核纤层蛋白的质粒与钠通道(SCN5A)质粒一起共转染人胚肾293细胞,进行全细胞膜片钳实验,并用荧光显微镜观察核纤层蛋白在细胞的分布。最后通过结构建模模拟突变位点对核纤层蛋白结构的影响。结果通过测序分析发现先证者及其父亲的核纤层蛋白第445位氨基酸残基上均存在一个错义突变,这一突变位点位于核纤层蛋白的免疫球蛋白样折叠的β2折叠上,导致第445位的中性疏水性氨基酸缬氨酸变为酸性亲水性氨基酸亮氨酸。载体构建成功后,将野生型钠通道分别与野生型及突变型核纤层蛋白共转染细胞,通过全细胞膜片钳实验发现：共转染突变型核纤层蛋白的钠通道,其峰值电流较共转染野生型核纤层蛋白时显著降低,同时,钠通道的激活曲线、失活曲线及失活后恢复曲线均未发生明显变化。通过荧光显微镜,我们发现突变的核纤层蛋白不再像野生型核纤层蛋白那样均匀分布于细胞核表面,而是聚集成团块状,形成镜下高亮的荧光颗粒。通过结构建模,我们发现由于突变的核纤层蛋白中的中性氨基酸缬氨酸被酸性氨基酸亮氨酸所取代,其免疫球蛋白样折叠中有三个p折叠以及多个侧链均发生了结构变化。结论通过本研究,我们在一个具有高猝死风险的家系中发现了核纤层蛋白的一个新的突变位点,年轻的先证者多次发生室速及室颤并有家族猝死史。突变氨基酸是位于疏水核心β2折叠上的保守氨基酸,通过研究这个位于第445位氨基酸残基的错义突变(缬氨酸突变为亮氨酸)对细胞功能和结构的影响,我们发现突变的核纤层蛋白会降低钠通道的峰值电流,而这一降低的钠通道峰值电流通过早期除极导致恶性心律失常及猝死的发生；不仅如此,由于点突变所导致的结构改变,使突变的核纤层蛋白在核膜周围发生了聚集。第三部分 参松养心胶囊治疗心动过缓的机制研究背景心动过缓是指每分钟心率低于六十次,冠心病病人及老年人是心动过缓的高危人群。目前现有的可以加快心率的药物有阿托品、多巴胺、异丙肾上腺素、肾上腺素等,但是这些药物仅在需要时短期使用,而不会长期使用。如果药物治疗不能提高心率,那么病人可能就需要安装临时起搏器或者永久起搏器。但是,就我国我现状来看,起搏器的花费对普通家庭来说也是一笔不小的费用。所以,我们需要一种可以长期服用的,且可以有效的提高心率的药物。我国传统中药治疗心律失常已有数百年的历史了,参松养心胶囊(ShenSongYangXin, SSYX)就是这样一种历史悠久的治疗心率失常的传统中药。SSYX是由十二味中药组成的复方制剂,其组分包括人参、麦冬、山茱萸、丹参等。前期全细胞膜片钳的研究结果表明SSYX可以抑制多种离子通道的电流,还有研究表明SSYX可以有效减少室性早搏的次数,并可以治疗心动过缓。而且最近的一项随机双盲、安慰剂对照的多中心研究结果表明：SSYX可以有效治疗心动过缓。尽管目前积累了不少来自于基础和临床的研究结果,但是SSYX是如何发挥其治疗心动过缓的作用,尤其是它是通过影响哪些mRNA及蛋白从而发挥治疗作用,这些问题仍是悬而未决。目的本研究利用心动过缓的动物模型研究SSYX治疗心动过缓的分子机制,我们深入研究了SSYX给药前后对模型动物心脏组织的mRNA表达水平及蛋白质数量的影响,力求全面揭示SSYX治疗心动过缓的分子机制。方法我们将十八只兔子随机分为三组：假手术组、模型组和SSYX治疗组,然后记录兔子的心率并从心脏提取总RNA。随后,我们用基因芯片检测心脏的差异mRNA并用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)验证了芯片的结果,为了验证芯片的结果,我们还用膜片钳记录了SSYX给药前后的钙电流。最后,我们利用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技术检测了SSYX用药前后对模型动物心脏蛋白质数量的影响。结果窦房结损伤六周后,模型组兔子的RR间期明显延长,而SSYX给药四周后,延长的RR间期又明显缩短。表达谱芯片的结果则说明SSYX显著改变了心房的一些mRNA,这些mRNA包括影响起搏电流的mRNA、参与钙稳态调节的mRNA和信号通路相关mRNA。全细胞膜片钳的结果也再次说明了SSYX抑制钙电流,即确实会影响细胞的钙稳态,这一结果也验证了芯片的结果。此外,iTRAQ相对定量结果也发现,SSYX给药后肌浆网及线粒体上转运钙离子的通道RyR2、钙ATP酶和电压依赖性阴离子通道的数量显著增加,还有其他钙离子结合蛋白的数量亦显著增加；而参与物质代谢的蛋白质数量则显著减少。结论这一研究探讨了心动过缓状态下改变的mRNA,并进一步说明SSYX可以通过逆转这些心房内改变的mRNA表达水平,从而有效治疗心动过缓。SSYX可以明显降低钙电流,这一结果也与芯片的结果互相印证。在此基础上,我们还通过iTRAQ技术发现在蛋白水平上,心室肌肌浆网及线粒体上的钙通道蛋白的数量显著增加,这些结果均表明钙稳态的维持在SSYX治疗心动过缓的过程中发挥着重要作用。