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大豆中含有很多抗营养因子，其中，最主要的是大豆胰蛋白酶抑制因子（STI），它可影响蛋白质的消化率和利用率，并导致动物的多种不良生理反应。研究表明，在大豆中至少存在5种胰蛋白酶抑制因子，然而，目前仅报道了库尼兹型胰蛋白酶抑制因子（KTI）和鲍曼-伯克型胰蛋白酶抑制因子（BBI）两种类型抑制因子的分离方法。从实验操作和效果来看，国内外已经报道的STI分离纯化方法，不是分离过程繁琐就是纯化倍数低。因此，本研究以大豆种子为原料，探索既高效、便捷又效果好的KTI和BBI分离纯化方法，为今后对二者的进一步深入研究奠定理论基础。以大豆为原料，经过粗提液的制备和层析等方法研究一种纯化效率较高的Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制因子的分离纯化方法，并与一步法进行比较分析。选用吉育52大豆为原料，经研磨、脱脂、酸抽提、热变性、35%-75%(NH4)2SO4分步沉淀等制备KTI粗提液，再采用离子交换、亲和层析、葡聚糖凝胶等多步法和亲和层析一步法分别进行KTI的纯化并进行SDS-PAGE电泳、MALDI-TOF检测及N-端氨基酸测序以鉴定其纯度。结果表明，10g大豆通过多步法纯化得到纯化倍数为72.39倍的KTI，而通过一步法纯化得到的纯化倍数为28.85倍。这两种方法经SDS-PAGE电泳检测均得到单一条带，其近似分子量为19.4kD。对多步法分离纯化得到的KTI作进一步的纯度分析，经MALDI-TOF检测可知，KTI的精确分子量为22907.51Da；N-端氨基酸测序结果显示，该KTI与多种Kunitz家族胰蛋白酶抑制因子有较高的同源性。对上述结果进行比较分析，我们发现多步法的纯化倍数要远高于一步法，表明多步法要优于一步法；而且纯化得到的KTI与多种Kunitz家族胰蛋白酶抑制因子有较高的同源性。以大豆种子为原材料，经过粉碎、正己烷脱脂、50%乙醇抽提、65℃热变性、等电点沉淀和丙酮沉淀得到BBI粗提物。粗提液先后经过DEAE-52离子交换层析和胰蛋白酶-琼脂糖凝胶4B亲和层析得到BBI纯品，之后，进行尿素SDS-PAGE电泳、MALDI-TOF检测及N-端氨基酸测序以鉴定其纯度。结果表明，经过粗提液制备、离子交换层析和亲和层析后，BBI的比活力为882.31U·mg-1，比原来粗品17.62U·mg-1的比活力大约提高了50倍，活性回收达到了69.34%。SDS-PAGE电泳结果显示BBI的近似分子量为9.8kD，经MALDI-TOF检测BBI的精确分子量为8837.46Da，N-端氨基酸测序结果显示，BBI与多种Bowman-Birk家族胰蛋白酶抑制因子具有较高的同源性，其中，与Glycine max、Glycinesoja、Vigna marina、Phaseolus grayanus及mung bean的同源性分别为80%、80%、73%、72%和60%，说明纯化效果理想。