背景乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是部分双链的DNA病毒,目前全球约3.5亿人感染,长期慢性持续性感染可引起慢性肝炎、肝硬化、肝癌。HBV感染具有组织特异性和种属特异性。HBV感染的嗜肝性与肝脏特异性受体及肝脏富集的转录因子有关。我国科学家李文辉在HBV的研究方面取得了重大突破,他发现了HBV感染肝细胞的功能性受体钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白(Na+/taurocholate Cotransporting Polypeptide,NTCP)。NTCP是由SLC10A1基因编码的,是分布在肝细胞表面的受体蛋白,它既是胆汁酸肝肠循环中胆汁酸进入肝细胞的重要受体,又是HBV进入肝细胞的受体。HBV感染可以抑制NTCP的功能,从而导致胆固醇代谢和胆汁酸代谢发生一系列改变。法尼酯X受体(Farnesoid X receptor,FXR)属于核受体超家族中的一员,胆汁酸是FXR的内源性配体。FXR作为胆汁酸激活的核受体,通过调控一系列基因的表达,在脂代谢、糖代谢、胆汁酸代谢、肝脏保护、动脉粥样硬化、肠道菌群的生长和固有免疫中发挥重要的作用。然而,胆汁酸在HBV感染中的作用还不太清楚。HBV感染的患者,体内胆汁酸的合成增加,血清中总胆汁酸水平升高,这与转氨酶升高的趋势基本一致,并且使用熊脱氧胆酸治疗HBV感染也没有明显效果,所以,人们对胆汁酸在HBV感染中的作用一直不被重视,仅仅把它作为一个诊断指标而已。随着HBV受体的发现,人们对胆汁酸与HBV感染之间的关系也开始产生了浓厚的兴趣。目前,胆汁酸对HBV复制表达分泌过程及慢性持续性感染中的作用机制尚不清楚,为此,本文将初步研究胆汁酸受体FXR对HBV表达及分泌的影响。目的探讨胆汁酸及受体FXR对HBV转录表达及分泌的影响。方法(1)构建HBV增强子/启动子荧光素酶报告质粒pGL3-EN2/Cp,PCR扩增EN2/Cp片段,SacI和SmaI双酶切、纯化、连接、转化、测序。(2)在HepG2细胞中,共转染pAAV/HBV1.2,pFXR质粒或pGFP对照质粒,转染后24小时,荧光显微镜观察转染效率,然后加CDCA刺激24小时和48小时,收集胞内蛋白及胞外上清液,ELISA检测HBsAg和HBeAg表达及分泌。(3)在HepG2细胞中,共转染pHY106+wta,pFXR质粒或pGFP对照质粒,转染后24小时,CDCA刺激48小时,收集胞内蛋白及胞外上清液,ELISA检测HBsAg和HBeAg表达及分泌。(4)在HEK-293T细胞中,共转染pAAV/HBV1.2,pFXR质粒或pGFP对照质粒,转染后24小时,CDCA刺激48小时,收集胞内蛋白及胞外上清液,ELISA检测HBsAg和HBeAg的表达及分泌。(5)在HepG2细胞中,共转染pAAV/HBV1.2,pFXR质粒或pGFP对照质粒,转染后24小时,CDCA刺激48小时,提取细胞内总RNA,RT-PCR检测preC/pgRNA水平。(6)双荧光素酶报告基因分析,pGL3-EN2/Cp和pRL-TK或pFXR共转染于HepG2细胞中,CDCA处理48小时,通过双荧光素酶报告基因检测,分析FXR调控HBV转录的作用机制。(7)统计分析及作图。实验结果采用SPSS17.0软件进行独立样本t检验分析,P<0.05具有统计学意义。采用GraphPad Prism 5软件作图。结果(1)经测序和序列比对,成功构建pGL3-EN2/Cp质粒。(2)在转染pAAV/HBV1.2质粒的HepG2细胞中,CDCA处理24小时和48小时FXR显著促进HBeAg表达分泌(P<0.05);FXR虽然促进胞内HBsAg表达(P<0.05),但是细胞上清液中HBsAg含量无差异(P>0.05)。(3)在转染pAAV/HBV1.2质粒的HEK-293T细胞中,CDCA处理48小时,FXR显著促进HBeAg和HBsAg表达和分泌(P<0.05)。(4)在转染pHY106+wta质粒的HepG2细胞中,CDCA处理48小时,FXR显著促进HBeAg表达(P<0.05)。(5)在转染pAAV/HBV1.2质粒的HepG2细胞中,RT-PCR检测结果显示FXR促进preC/pgRNA基因表达(P<0.05)。(6)双荧光素酶报告分析显示,FXR与HBV核心启动子EN2/Cp结合,荧光素酶活性是对照组的5倍,显著促进萤火虫荧光素酶表达(P<0.05)。结论HBV感染导致胆汁酸水平的升高,胆汁酸受体FXR活化后调控HBV转录表达及分泌过程,本研究初步得出以下结论:(1)在HepG2细胞中,FXR促进了HBeAg的表达和分泌。(2)在HepG2细胞中,FXR促进胞内HBsAg表达,而胞外HBsAg的分泌水平没有差异。FXR相对的抑制了HBsAg的分泌。(3)荧光素酶报告基因分析和RT-PCR实验证明FXR在转录水平促进HBV表达。