目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是临床上常见而严重的慢性微血管并发症之一,临床特征为蛋白尿漏出,肾功能进行性恶化,病理变化为肾小球滤过率改变,基底膜增厚,系膜细胞增宽,直至肾小球硬化,发展至肾功衰竭。其发病率随着糖尿病患者数的增加,愈来愈高,严重威胁着人类的健康。DN的发病机制复杂而多,近几年来,很多研究表明,各种原因导致在肾小球滤过膜的足细胞损伤参与了DN产生发展中起很大的作用,因此对足细胞的研究而改善足细胞功能的药物成为治疗DN的关注点。导师南征教授认为,“毒损肾络,邪伏膜原”理论是DN的主要病因病机,提出了“解毒通络,益肾导邪,疏利膜原”治疗思路与方法。榛花消肾安胶囊是南征教授常用的治疗DN的经验方,在临床上疗效显著。通过本实验观察实验性糖尿病大鼠的肾脏及足细胞相关蛋白CD2AP、podocin、α-actinin-4、podocalyxin、α3β1-integrin的表达影响,表明“榛花消肾安胶囊”治疗DN的有效性。方法:1将wistar雄性大鼠70只适应性喂养一周后,随机分为正常对照组(10只)和造模组(60只),造模组腹腔注射1%STZ(50mg/kg)以制备实验性糖尿病大鼠模型,72小时后,尾静脉采血,测空腹血糖≥16.7mmol/L者视为造模成功。将造模成功的51只大鼠随机分为糖尿病模型组11只,榛花消肾安胶囊高、中、低剂量组,厄贝沙坦片组各10只。中药高、中、低剂量组分别以1g/kg/d,0.5g/kg/d,0.25g/kg/d,予榛花消肾安胶囊混悬液灌胃;西药对照组予厄贝沙坦混悬液20mg/kg/d灌胃,连续灌胃观察12周。观察大鼠一般状态,检测空腹血糖、24h尿微量白蛋白、TC、TG,Scr、BUN等。2应用光学显微镜和透射电镜观察肾组织超微结构及足细胞改变,观察榛花消肾安胶囊对糖尿病大鼠肾脏病理结构的影响。3采用免疫组化方法观察足细胞裂孔隔膜CD2AP、podocin的蛋白表达;应用荧光定量PCR技术检测CD2AP、podocin m RNA表达。4采用免疫组化方法观察足细胞足突及粘附分子α-actinin-4、podocalyxin的蛋白表达;应用实时定量PCR技术检测α-actinin-4、podocalyxin、α3β1-integrin m RNA表达。结果:1正常对照组大鼠的精神状态良好,毛发光泽,反应灵敏,体重持续增加。DM模型组大鼠的精神状态较差,毛发无光泽、竖起,活动缓慢,三多一少(多饮、多食、多尿、消瘦)症状明显,少部分大鼠身体的某些部位出现脓肿、溃烂,实验期间死亡4只大鼠。中药高、中、低剂量组和西药对照组大鼠的精神状态、活动反应不如正常对照组大鼠,体重增加速度较慢,后期的尿量较前期减少,实验期间中药高、中、低剂量组各死亡2只大鼠,西药对照组死亡2只大鼠。2肾脏组织光镜观察:DM模型组:大鼠的肾小球系膜区弥漫性增宽,MC轻度增生,部分毛细血管受压而塌陷,GBM增厚,肾小球ECM增多,肾间质炎性细胞浸润,间质纤维组织增生,肾小球囊粘连。中药高、中、低剂量组及西药对照组:肾小球结构也有类似病理改变,但较DM模型组明显减轻,大鼠肾小球ECM增多以及MC增生较DM模型组明显减轻,大部分毛细血管腔呈开放状态,间质纤维组织的增生较DM模型组减少。中药高、中、低剂量组、西药对照组与DM模型组比较,肾组织损伤均明显减轻(P<0.05)。电镜观察:DM模型组:大鼠肾小球滤过膜的改变明显,GBM弥漫性增厚,内皮细胞增生,内皮细胞广泛融合,足细胞的数目减少,足细胞足突广泛融合,系膜区扩大,系膜基质明显增多。中药高、中、低剂量组与西药对照组:上述的病理改变均不同程度减轻,大鼠的肾小球毛细血管内皮细胞正常,足突部分融合,GBM未见增厚,系膜区未见明显扩大。3中药高、中、低剂量组的体重和尿量均较DM模型组有显著性差异(P<0.01);且中药高、中、低剂量组间均有显著差异(P<0.01);中药高剂量组的尿量改善情况明显优于西药对照组(P<0.01)。在第4、8、12周检测各组大鼠的24h尿微量白蛋白的含量(ALB)。DM模型组、中药各剂量组、西药对照组大鼠的ALB含量逐渐增多,而且每个时期较正常对照组明显升高(P<0.01);中药高、中、低剂量组和西药对照组,从第4周开始ALB的含量较DM模型组均明显降低(P<0.01);中药高剂量组与西药对照组比较,有显著差异(P<0.05)。DM模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠的尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)水平均明显高于正常对照组(P<0.01);中药高、中、低剂量组及西药对照组大鼠的BUN、Scr水平均明显低于DM模型组(P<0.01);中药高、中、低剂量组间有显著性差异(P<0.01);中药高剂量组与西药对照组比较,无明显差异(P>0.05)。4 DM模型组,中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠血糖均明显高于正常对照组(P<0.01);中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠血糖均明显低于DM模型组(P<0.01);中药高、中剂量组空腹血糖较西药对照组明显降低(P<0.01);西药对照组与中药低剂量组无明显差异(P>0.05);中药高剂量组与低剂量组间有显著性差异(P<0.01)。5测定各组大鼠的胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量。DM模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠TC含量均明显高于正常对照组(P<0.01);中药高、中、低剂量组TC含量较DM模型组均明显减少(P<0.01);西药对照组与DM模型组间无明显差异(P>0.05);中药高、中剂量组与低剂量组间有显著性差异(P<0.01);中药高、中剂量组与西药对照组间有明显差异(P<0.01)。DM模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠的TG含量均高于正常对照组(P<0.01);中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠TG含量均明显低于DM模型组(P<0.01);中药高、中剂量组与低剂量组间有显著性差异(P<0.01);中药高、中、低剂量组与西药对照组间有显著性差异(P<0.01)。6应用免疫组化法以及实时定量PCR检测各组大鼠肾组织中CD2AP表达。光镜下所见:正常对照组的CD2AP在肾小球中沿着毛细血管祥呈线样分布均匀,而在足细胞的胞质侧表达,表达较强;DM模型组的CD2AP表达明显较少,部分区域节段性缺少;中药高、中、低剂量组和西药对照组CD2AP表达较DM模型组明显改善。灰度值检测结果:DM模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠的CD2AP灰度值均低于正常对照组(P<0.01)。中药高、中、低剂量组和西药对照组大鼠灰度值均高于DM模型组(P<0.01)。中药高剂量组与中药低剂量组间有显著差异(P<0.01);中药高剂量组与西药对照组间无明显差异(P>0.05)。DM模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠的CD2AP m RNA含量均明显低于正常对照组(P<0.01);中药高、中、低剂量组和西药对照组大鼠的CD2AP m RNA含量均明显高于DM模型组(P<0.01);中药高、中、低剂量组间有显著差异(P<0.01);中药高剂量组与西药对照组间无明显差异(P>0.05)。7应用免疫组化法以及实时定量PCR检测各组大鼠肾组织中podocin表达。光镜下所见:正常对照组的podocin,在肾小球中沿着GBM呈线状分布均匀;DM模型组的podocin表达明显减少;中药高、中、低剂量组、西药对照组的podocin表达较DM模型组均明显改善。灰度值检测结果:DM模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠的podocin灰度值均低于正常对照组(P<0.01)。中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠的灰度值均高于DM模型组(P<0.01)。中药高剂量组与低剂量组间有明显差异(P<0.01);中药高剂量组与西药对照组间无明显差异(P>0.05)。实时定量PCR结果:DM模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠的podocin m RNA含量均明显低于正常对照组(P<0.01);中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠的podocin m RNA含量均明显高于DM模型组(P<0.01);中药高、中、低剂量组间有显著差异(P<0.01);榛花消肾安胶囊高剂量组与西药对照组间无明显差异(P>0.05)。8应用免疫组化法以及实时定量PCR检测各组大鼠肾组织中α-actinin-4的表达。光镜下所见:正常对照组的α-actinin-4蛋白沿着肾小球基底膜毛细血管样点线状分布均匀;DM模型组的α-actinin-4蛋白表达明显高于正常对照组;中药高、中、低剂量组和西药对照组的α-actinin-4蛋白表达较DM模型组减弱。灰度值检测结果:DM模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠α-actinin-4灰度值均高于正常对照组(P<0.01)。中药高、中、低剂量组和西药对照组大鼠灰度值均低于DM模型组(P<0.01)。中药高剂量组与中药中、低剂量组间有显著差异(P<0.01);中药高剂量组与西药对照组间有显著差异(P<0.05)。DM模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠的α-actinin-4m RNA含量均明显高于正常对照组(P<0.01);中药高、中、低剂量组和西药对照组α-actinin-4 m RNA含量均低于DM模型组(P<0.01);中药高剂量组与西药对照组间无明显差异(P>0.05);中药高、中、低剂量组间有显著性差异(P<0.01)。9应用免疫组化法以及实时定量PCR检测各组大鼠肾组织中podocalyxin的表达。光镜下所见:正常对照组肾小球内podocalyxin在肾小球中沿着GBM呈线状分布均匀。DM模型组肾小球内podocalyxin蛋白表达节段性缺少。中药高、中、低剂量组、西药对照组表达轻微缺失,但较DM模型组增加。灰度值检测结果:DM模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠podocalyxin灰度值均低于正常对照组(P<0.01)。中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠灰度值均高于DM模型组(P<0.01)。中药高剂量组与中药中、低剂量组间有显著差异(P<0.01);中药高剂量组与西药对照组间有显著差异(P<0.05)。10应用实时定量PCR检测各组大鼠肾组织中α3β1整合素的表达。DM模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠α3β1整合素m RNA含量均明显低于正常对照组(P<0.01);中药高、中、低剂量组、西药对照组α3β1整合素m RNA含量均高于DM模型组(P<0.01);中药高、中、低剂量组间有显著性差异(P<0.01);中药高剂量组与西药对照组间无明显差异(P>0.05)。结论:本实验研究结果说明,榛花消肾安胶囊能够改善实验性DM大鼠一般状态;减轻肾组织病理结构,减少尿微量白蛋白的排出;改善糖脂代谢。同时,能够改善足细胞相关蛋白CD2AP、podocin、podocalyxin的表达,抑制α-actinin-4蛋白的表达,从而减轻肾组织的损害,改善肾功能,延缓DM发展。导师南征教授认为,DN的病机关键是“毒损肾络,邪伏膜原”。本实验根据病机关键,应用“解毒通络、益肾导邪、疏利膜原”理论与西医学DN的发病机制,肾小球滤过膜和足细胞结构及其功能联系在一起。榛花消肾安胶囊在解毒通络、益肾导邪、疏利膜原的治疗大法下,通过干预足细胞相关蛋白CD2AP、podocin、α-actinin-4、podocalyxin、α3β1-integrin的表达及起治疗DN的作用。