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PAI-2分子中的CD螺旋间区是PAI-2与其他蛋白质相互作用的结构域,而PAI-2的这段CD螺旋间区在PAI-2抑制TNF-α诱导细胞凋亡的过程中发挥重要作用,为了研究TNF-α诱导细胞凋亡过程中,有那些蛋白质通过该CD螺旋间区与PAI-2相互作用,以及这些相互作用对PAI-2抑制细胞凋亡功能的影响,首先要确定具体有哪些蛋白质可能与PAI-2CD螺旋间区相互作用,因此我们课题组构建了凋亡过程中的HeLa细胞cDNA文库,并以PAI-2这段CD螺旋间区为诱饵,利用酵母双杂交系统筛选与PAI-2相互作用的蛋白质.在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺失的选择性培养基上,共长出40个酵母克隆.经过进一步检测β半乳糖苷酶活性,获得36个阳性克隆,去除具有独立转录活性的克隆,最终获得24个能与PAI-2 CD螺旋间区相互作用的阳性克隆.将这些cDNA序列测定结果提交Genbank进行同源性分析,发现有5种已知蛋白质能与PAI-2相互作用,其中包括IRF-3、COX7C、PRPF8、PSMB1、PPPSV3.在此基础上,我们主要对PSMB1和PRPF8进行了进一步的研究.通过PCR我们获得了PSMB1全长cDNA,进一步GST-pulldown的实验证实,PAI-2与PSMB1确实存在相互作用.实验结果中,PAI-2及其CD缺失突变体的条带仅出现在大约46 kD和42 kD处,并没有发现有分子量较大的PAI-2-即泛素化的PAI-2,或分子量较小的PAI-2-即己被分解的PAI-2条带.另外我们也获得了PRPF8羧基端的部分序列,进一步用免疫共沉淀的实验证实,PAI-2与PRPF8在HeLa细胞内确实存在相互作用.这种相互作用无需TNF-α的信号促发,在细胞核内外都可以发生.正常情况下,大部分的PRPF8存在于细胞核内,并且在此发挥其作用,而胞内型PAI-2在细胞内分布均匀,没有明显的细胞核和细胞浆的差异,而在PAI-2的序列上也没有保守的核定位序列(nuclear localization signal,NLS),为了更清楚的研究两者之间的关系,我们课题组构建了在PAI-2的羧基末端加上一个由5个氨基酸Lys-Lys-Lys-Arg-Lys(KKKRK)组成的核定位序列,与真核表达载体pEGFPC3重组,构建绿色荧光蛋白与PAI-2入核突变体融合蛋白表达质粒.转染HeLa细胞,荧光显微镜下比较野生型PAI-2与PAI-2的入核突变体在HeLa细胞内分布的差异.综上所述,通过该次研究我们找到了一些能与PAI-2相互作用的蛋白质,并从PAI-2与PSMB1蛋白质之间的相互作用、PAI-2与PRPF8蛋白质C末端之间的相互作用、凋亡前后PAI-2在细胞内的定位这三个方面对PAI-2抑制TNF-α诱导的细胞凋亡的分子机制进行了初步的研究.