蒙古马是世界上古老的品种,也是优秀的地方品种。通过冷冻精液人工授精技术可以加快蒙古马提纯复壮及提高本品种选育进程。由于农业机械化的推进及国内对马繁殖技术关注度的下降,目前还没有人对蒙古马精子的冷冻保存方法进行过系统的研究,仍未探索到一种成熟有效并可推广到生产实践中的冷冻保存技术程序。为了研究出在实际生产中能够推广应用的蒙古马精液冷冻保存方法,进一步完善蒙古马冷冻精液品质,本研究对蒙古马精液冷冻程序及冷冻保护液配方的进行了优化,同时,使用最优冷冻保护液配方和冷冻保护程序对蒙古马精液进行了冷冻,并开展了人工授精受胎率验证试验,其结果如下:(1)将蒙古马精子置于不同渗透压(30、50、100、200、240、300、360、420、480、550、600mOsm/kg)的盐水溶液中孵育后,测定其前进运动精子百分比(PM)和精子质膜完整率(MI)。结果显示,蒙古马精子渗透压耐受范围为200～400mOsm/kg,从此渗透压再回到等渗状态时,其活力是可以恢复的,而渗透压超出这一范围其活力恢复能力降低。2)比较了沉降离心法之不同离心力和离心时间(400 g,15 min;600 g,10 min;1000 g,7 min)和缓冲离心法(使用商品化离心垫)对蒙古马精液冻前冻后精液质量和精子损失率的影响,结果显示,600 g,10 min组离心方法获得的精液冷冻前后TM、PM、VAP、VSL、MI和精子损率均与使用离心垫进行离心的对照组无显著差异(P<0.05),该方法可代替商品化离心垫使用。(3)比较了不同平衡时间(0 min、100 min和120 min)、不同冷冻降温速率(液氮熏蒸高度2 cm、3 cm和4 cm)对蒙古马精液冷冻效果的影响,结果显示,蒙古马精液冷冻之前需进行一段时间的冷却平衡。获得可接受的解冻后质量最佳平衡时间是应将蒙古马精子冷却至4℃并平衡100 min。距离液氮面高度3 cm的熏蒸高度获得的冷冻效果与程序化冷冻仪相当。(4)以INRA82+2%卵黄基础液,添加4种不同浓度甘油(2%、3%、4%和5%)和二甲基甲酰胺(4%、5%、6%和7%)作为冷冻保护剂对蒙古马精液进行冷冻,分别测定了在4℃平衡100 min后的质量指标和冷冻-解冻后的质量指标。结果显示,冷冻-解冻后,3%gly、4%gly、5%gly和7%DMF组TM和PM均显著高于其他组(P<0.05);添加2%gly组、3%gly组和7%DMF组MI显著高于其他组(P<0.05)。综合考虑TM和MI,蒙古马精液冷冻保护液中适宜甘油比例为3.0%。(5)比较了 8种不同冷冻保护液:INRA82基础液+5种不同浓度低密度脂蛋白(LDL,0.5%、1%、2%、3%和 5%),INRA82 基础液+2%卵黄,INRA82 基础液+2%离心卵黄和INRAFreeze商品稀释液对蒙古马精液冷冻效果的影响。以上冷冻保护液均添加了 3%甘油。结果显示,在冷冻-解冻后,2%LDL、2%卵黄和INRAFreeze组TM、PM、VAP、VSL、VCL、MI和AI均显著高于其他组(P<0.05)。表明,2%的LDL和2%的卵黄对蒙古马精子可能具有低温保护作用,2%的卵黄提取步骤简单,更容易获得。(6)在脱脂奶基础液上,选择4种不同浓度的葡萄糖(0、67、125和147 mM)与270mM乳糖、50mM棉子糖组合,制备成精子低温保存稀释液,比较了其对蒙古马精液冷藏保存的效果。结果显示,125 mM葡萄糖+270 mM乳糖对蒙古马精液低温保存质量有显著提高作用。(7)以INRA82作为基础稀释液,分别添加谷胱甘肽(0、5、7、10和20mg/mL)、海藻糖(0、25、35和50 mg/mL)和联合添加谷胱甘肽+海藻糖(0+0、5+35、5+50、7+35和7+50mg/mL)制备成含有不同氧化剂的冷冻保护液,将浓缩处理后的马精子分别置于上述稀释液中稀释、冷冻和解冻,利用精子常规品质检测方法和酶联免疫分析法,检测精子常规品质和抗氧化相关指标。结果显示:1)5 mg/mL谷胱甘肽对精子TM、PM和MI均有提高,可降低精液中MDA含量,添加谷胱甘肽可显著提高CAT和GSH-PX活性(P<0.05);35和50mg/mL海藻糖可提高TM、PM、AI和MI,且35 mg/mL海藻糖可显著降低MDA含量(P<0.05);2)联合添加5mg/mL谷胱甘肽+35 mg/mL海藻糖可显著提升马精液的TM、PM、AI和MI(P<0.05),还可显著降低MDA含量(P<0.05),提高SOD活性和GSH-PX活性。综上,联合添加5 mg/mL谷胱甘肽+35 mg/mL海藻糖一定程度上可通过改变酶活性,对精子氧化应激产生保护作用,提高了马冷冻-解冻后精液质量。(8)在以上研究基础上,筛选出一套自配冷冻保护液配方和简便冷冻程序,将自配冷冻保护液组、INRAFrezee组、鲜精INRA96稀释组处理的精液用于30匹母马共60个排卵周期进行人工授精,通过妊娠检查,进行受胎率统计。结果表明,鲜精人工授精受胎率为70%,INRAFreeze冻精人工授精受胎率为50%;自配冷冻保护液冻精人工授精受胎率为50%。综上所述,经过筛选的自配蒙古马精液冷冻保护液成本低廉、制备步骤少、简单易操作,制备条件温和易控制,冻后活力在35%以上,情期受胎率达到了 50%,能够满足生产需要。