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谷氨酸棒杆菌是微生物发酵生产氨基酸工业的经典菌种,具有产酸能力强的特点,研究其代谢合成琥珀酸等有机酸,对于开发琥珀酸生产新方法和扩宽谷氨酸棒杆菌的应用具有促进意义。本文从谷氨酸棒杆菌产琥珀酸条件和代谢途径分析、传统诱变和基因敲除改造菌种两方面开展研究,获得了一株消除副产物乳酸且琥珀酸产量提高的菌株。具体结果如下:比较实验室保藏的14株谷氨酸产生菌在缺氧条件下的产有机酸特性,以积累琥珀酸浓度相对高的嗜乙酰乙酸棒杆菌Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870为出发菌株,对其在缺氧条件下积累有机酸的条件和代谢通量进行研究。结果显示:该菌积累有机酸的浓度随菌体密度的增大而增加,其中琥珀酸和乳酸积累的最适pH分别为7.5和8.0,最高浓度分别为22.5 g/L与60 g/L。碳酸盐是影响产有机酸的主要因素。比较ATCC 13870在NaHCO3浓度为40与400 mmol/L时的代谢通量,发现PEP节点明显受NaHCO3浓度的影响,而PYR节点受环境因素的影响不明显,说明如果切断生成乳酸的代谢支路,更多的碳代谢流有可能流向琥珀酸支路。对C.acetoacidophilum ATCC 13870进行吖啶黄-紫外诱变,筛选得到一株琥珀酸产量为23.8 g/L,比原菌提高14.4%的菌株Ⅱ-169;其副产物乳酸产量为52.5 g/L,比原菌降低12.5%。采用sacB基因为反向筛选标记的同源重组染色体基因敲除系统,敲除ATCC13870的乳酸脱氢酶基因,首先扩增基因ldh的上下游序列,再利用重叠PCR将ldh的上下游序列拼接并装入pK19mobsacB构建基因敲除载体pK19mobsacB-Δldh,通过电击将其转化导入ATCC13870中,通过卡那抗性、蔗糖选择压力筛选获得ldh基因缺失菌株C.acetoacidophilumΔldh。经PCR验证和LDH酶活测定,证实编码LDH的基因ldh被成功敲除。C.acetoacidophilumΔldh产琥珀酸初步试验表明:在缺氧条件下,流向乳酸的代谢流量为零,流向琥珀酸的代谢流量比ATCC13870提高了159%。当以葡萄糖和碳酸镁为底物时,C.acetoacidophilumΔldh的琥珀酸产量达到54.4 g/L,比ATCC 13870和Ⅱ-169的琥珀酸产量分别提高了43.6%和35.8%。