【背景】胃癌是世界上第三大致死性癌症,根据Lauren分型主要分为肠型和弥散型,且前者更为常见。目前普遍认为Correa模型是肠型胃癌发展的主要模式:慢性浅表性胃炎-萎缩性胃炎-肠化生（Intestinal metaplasia,IM）-异型增生-胃癌,通过阻止癌前病变的进展或许可以防止胃癌的发生。虽然大量研究已证实发生胃黏膜IM的患者,其患胃癌的风险会显著升高,但是关于IM的启始和进展机制目前尚不清楚。有研究表明,伴有高浓度胆汁反流的患者,其胃黏膜IM的病变程度和范围也更为严重。肝细胞核因子（Hepatocyte nuclear factor 4α,HNF4α）在维持肝细胞正常的分化、发育及脂质代谢过程中发挥了至关重要的作用。值得注意的是,研究人员们发现该分子在肠道组织中也呈现出高表达状态,并且参与了肠道的分化、发育过程以及功能的维持。本课题组在前期研究中发现胆汁酸（Bile acids,BA）可以引起HNF4α的显著升高,且它可以通过转录激活尾型同源核转录因子2（Caudal-related homeobox transcription factor 2,CDX2）促进下游肠标志分子的表达,进而诱导胃细胞向肠型细胞的转变。但是,BA对胃细胞中HNF4α分子的激活机制还有待进一步探索。【目的】明确HNF4α的激活途径并进一步揭示BA对胃细胞的促IM作用机制。【方法】1.利用CRISPR/Cas9技术构建在Lgr5阳性胃干细胞中特异性过表达HNF4α基因的小鼠模型,利用苏木素-伊红（Hematoxylin-Eosin,HE）染色、电镜检测和阿利新蓝-过碘酸-雪夫染色（Alcian blue-Periodic acid-Schiff stain,AB-PAS）等方法观察小鼠胃黏膜变化,利用免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）染色检测HNF4α、HDAC6表达量,免疫荧光（Immunofluorescence,IF）染色技术用于检测HNF4α和Lgr5共定位情况;2.使用脱氧胆酸（Deoxycholic acid,DCA）刺激人胃细胞系及小鼠原代胃黏膜细胞后,通过实时定量PCR（Quantitative real-time PCR,q RT-PCR）、蛋白免疫印迹（Western blot）实验及IF等技术检测组蛋白去乙酰化酶6（Histone deacetylase 6,HDAC6）、HNF4α、miR-1和肠标志分子粘蛋白2（MUCIN2,MUC2）、Krüppel样因子4（Krüppel-like factor 4,KLF4）及CDX2的表达水平变化;3.收集正常、胃炎及IM组织切片,购买包含正常及IM组织的组织芯片,利用IHC及原位杂交技术（In situ hybridization,ISH）在这些组织上检测HDAC6、HNF4α及miR-1表达水平。利用q RT-PCR技术检测以上分子在IM患者的正常及IM活检组织中表达量;4.通过JASPAR、PROMO及Target Scan等软件预测HNF4α与HDAC6启动子区结合序列、miR-1与HDAC6及HNF4α的3′UTR结合序列,利用荧光素酶报告基因技术及染色质免疫沉淀技术（Chromatin immunoprecipitation,Ch IP）进行相应的检测;5.通过Ch IP实验检测叉头核蛋白P3（Forkhead box protein 3,FOXP3）分子启动子区及CNS区组蛋白乙酰化水平还有HDAC6与这两个区域的结合情况。【结果】1.HNF4α转基因小鼠的构建与鉴定分别收集WT小鼠和Rosa26Hnf4α小鼠的胃黏膜组织进行Lgr5及HNF4α荧光共定位检测,结果显示在Rosa26Hnf4α小鼠中Lgr5阳性的胃腺体底部区域出现了HNF4α的特异性表达。同时,我们还利用IHC技术分别检测了WT和Rosa26Hnf4α小鼠胃黏膜中HNF4α分子表达量,结果显示该分子特异性表达于黏膜腺体的底部,这些结果表明小鼠模型构建成功。分别对两组小鼠的组织进行电镜检测后可以看到在Rosa26Hnf4α小鼠胃黏膜细胞中粘液分泌明显增加。HE染色结果显示与WT型小鼠相比,Rosa26Hnf4α小鼠的胃黏膜出现了萎缩。接下来为了确定在转基因小鼠是否出现了IM改变,我们分别取WT小鼠和Rosa26Hnf4α小鼠的胃、小肠及大肠组织进行AB-PAS染色。可以看到两组小鼠的肠组织染色均呈现出蓝色,WT小鼠的胃黏膜表面呈紫红色且腺体未见着色,但是在Rosa26Hnf4α小鼠近胃窦区黏膜腺体底部则出现了与肠黏膜中类似的蓝色着色。2.HDAC6在IM细胞中表达升高对Ctrl组细胞及DCA处理组细胞进行RNA测序（RNA-sequencing,RNA-seq）,结果显示DCA可以引起HDAC6明显升高,且KEEG数据分析结果则表明DCA与肿瘤的发生及细胞内细胞转导密切相关。接下来我们对GES-1及AZ521细胞分别进行浓度梯度DCA处理（0、25、50、75和100μM）,24h后收集蛋白进行HNF4α和肠标志分子MUC2、KLF4及CDX2检测,结果显示100μM的DCA可以引起这些分子的明显升高。同时,在此条件下HDAC6的蛋白及信使RNA（Messenger RNA,m RNA）水平也显著提高。接着,我们还对小鼠胃黏膜细胞进行DCA处理并检测以上分子表达水平,结果与在人的胃细胞系中的检测结果类似。IF实验结果再次证实100μM的DCA可以激活GES-1细胞中的HDAC6和HNF4α,且前者主要位于细胞浆,后者主要位于细胞核。在正常胃组织、胃炎组织及IM组织中对HDAC6及HNF4α进行IHC染色后可以看到,二者在IM组织中的表达水平显著高于正常及胃炎组织,且其高表达水平也主要出现于IM腺体中。相关性分析结果显示,HDAC6和HNF4α在IM组织中的表达水平呈正相关。3.HDAC6与HNF4α之间的相互调控分别在GES-1和AGS细胞中对HNF4α进行过表达和敲减处理,western blot结果显示该分子可以对HDAC6进行正向调控。同时对GES-1细胞进行DCA及si HNF4α处理则发现该分子的减少会抑制BA对HDAC6及下游肠标志分子的激活作用。双荧光素酶报告基因结果显示HNF4α可以通过结合于HDAC6启动子区进而促进其转录。此外,对Rosa26Hnf4α小鼠组织进行IHC染色可以看出,与WT小鼠相比,转基因小鼠胃黏膜中HNF4α的表达区域同时出现了HDAC6的表达。接下来在胃细胞中进行HDAC6的表达调控,发现HDAC6会促进下游肠标志分子的表达,同时我们发现该分子对HNF4α也具有激活作用。结合RNA-seq检测、查阅文献以及生物信息学分析的结果,我们推测FOXP3可能是HDAC6与HNF4α的中间作用分子。对GES-1细胞及小鼠原代细胞进行DCA处理后可以看到FOXP3出现降低,且HDAC6的过表达也引起其减少。利用IHC技术检测该分子在胃炎及IM组织中的表达水平,可以看到FOXP3在胃炎组织中显著高于IM组织。组蛋白乙酰化水平检测结果显示HDAC6可以降低FOXP3启动子区及CNS区组蛋白H3Ac、H3K9Ac、H3K27Ac及H4Ac的乙酰化水平,Ch IP实验表明HDAC6可以结合于FOXP3分子的启动子区和CNS区。双荧光素酶报告基因技术及Ch IP技术检测结果显示FOXP3可以对HNF4α进行转录抑制。4.miR-1靶向调控HDAC6/HNF4α首先对胃细胞系及小鼠原代细胞进行DCA处理,可以看到在这些细胞中miR-1均出现了明显的降低。利用ISH及q RT-PCR技术检测其在正常及IM组织中的表达水平,可以看出在后者组织中该小RNA（micro RNAs,miRNAs）呈明显的低表达状态。接下来在GES-1、AGS及BGC-823细胞中分别进行miR-1的上调或者敲低处理,结果显示miR-1可以对HDAC6、HNF4α及下游肠标志分子进行负性调节。根据mir Walk2.0（https://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/）,Pic Tar（https://picta r.mdc-berli n.de/）and Target scan（https//www.targe scan org/vert＿72/）三个网站的预测结果,我们分别构建了HDAC6和HNF4α的wt-3′UTR和mut-3′UTR载体,通过双荧光素酶报告基因技术检测载体活性可以发现,miR-1可以通过特异性靶向二者的3′UTR区对它们发挥抑制活性的作用。蛋白水平的检测结果进一步证实以上结果,且它可以通过降低HDAC6和HNF4α表达水平进而抑制下游的肠标志分子。5.DCA诱导转基因小鼠胃黏膜出现IM细胞样改变在四组小鼠分别进行PBS或者DCA处理12个月后处死小鼠,对胃黏膜组织进行HE染色,可以看出在Rosa26Hnf4α小鼠及加用DCA后的Rosa26Hnf4α小鼠胃黏膜的鳞柱上皮交接区（Squamocolumnar junction,SCJ）出现异常增大的腺体结构。此外,这两组小鼠的胃窦区黏膜则出现了萎缩的现象。AB-PAS染色结果显示HNF4α在胃干细胞的表达可以促进胃黏膜出现肠样粘液的分泌,且在DCA的刺激下转基因小鼠的胃黏膜还出现了与肠杯状细胞染色、形态及大小均高度类似的结构。IHC染色结果显示胃黏膜干细胞中HNF4α的表达可以诱导HDAC6的出现,而后者的升高则抑制了胃黏膜细胞中FOXP3的表达水平,这也进一步在体内水平证实了HDAC6、FOXP3及HNF4α之间的表达调控关系。【结论】本研究发现,BA会引起胃细胞内miR-1表达量的明显降低,而后者又可以同时靶向HDAC6和HNF4α分子导致二者的升高,进而促进下游肠标志分子的表达。此外,HNF4α和HDAC6之间存在相互调控关系,前者可以对后者进行转录激活,而后者又通过对FOXP3分子进行表观遗传调控进而影响HNF4α的转录活性,最终形成一个闭合的正反馈环路。因此,BA促进了胃细胞内miR-1介导的HDAC6/HNF4α环路的活化,接着引起了下游肠标志分子的不断升高及细胞的肠型转化。明确胃细胞中HNF4α相关的信号网络将有助于我们进一步揭示BA诱导胃黏膜IM的分子机制,而阻止HDAC6/HNF4α信号环路的活化可能会为干预IM甚至肠型胃癌的发生提供新的思路。