研究背景随着社会的不断发展,交通设施更为发达,机动车辆增多,施工工地和工厂多,所导致的交通事故和工伤相应增加,创伤伤员逐年增多。在这些创伤中,颅脑损伤(Traumatic brain injury, TBI)的发生率较高,并且是创伤致死原因中的首要因素,在存活病例中,其致残率也较高,给患者带来极大的痛苦,也给社会和患者家人带来负担。尽管在颅脑损伤的院前救护、影像学技术、危重症急救和康复锻炼等临床技术方面已经有了显著的进步,但治疗的目的仅在于尽可能保存残留的神经功能,降低致死致残率,而对于已经发生的神经损害尚无有效的治疗手段。如何促进颅脑损伤后神经再生和神经功能恢复是当前研究的热点及难点。TBI后修复面临的主要问题是：原发性和继发性的神经元的缺失,以及受损部位周围的局部微环境存在一些不利于轴突再生的因素,主要有髓鞘相关轴突生长抑制因子(Nogo-A、MAG、Omgp等)、炎症反应、细胞外基质(ECM)改变、胶质瘢痕的形成等,因此治疗脑损伤的策略之一在于补充缺失的神经元,改善损伤局部的微环境。虽然大量的实验已经表明,无论是在成年还是未成年的动物中枢神经系统(central nerve system, CNS)内都有神经干细胞(neural stem cells, NSCs)的存在,这类细胞群能自我更新,并且具有分化成神经元和神经胶质细胞的能力,在一定条件下可以进行增殖、迁移和分化,在一定的程度上参与修复缺损的神经功能,但是在成体中枢神经损伤后此类细胞再生能力有限,远远不能完成神经功能再生修复的功能,特别是大面积受损的中枢神经组织,仅靠自身的神经干细胞修复是无法实现的。随着干细胞研究的不断进步,已经有大量的研究通过自体或者异体移植不同的干细胞(包括不同来源的成体间充质干细胞和胚胎干细胞等)而取得了一些令人振奋的效果,所以干细胞移植治疗颅脑创伤后中枢神经功能缺损为我们带来了新的希望。在种子细胞来源方面,骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs)来源丰富易获取,有研究表明成人骨髓基质细胞在体外可快速有效地诱导分化成为成人骨髓源性神经干细胞(human adult bone marrow-derived neural stem cells, MDNSCs),而且成人骨髓源性神经干细胞具有和自身脑源性的神经干细胞相似的生物学特征,如果应用于患者自身移植,避免了可能的免疫排斥反应,并且没有伦理争议。除了要解决种子细胞的问题外,还要改善损伤局部的微环境,使其适于神经组织的修复,同时移植入外源性细胞替代失去功能或死亡的细胞,并与宿主细胞形成具有功能的整合,改善神经功能缺陷。组织工程支架材料的发展为解决这一问题带来了希望,支架材料类似于细胞外基质的结构和功能,提供种子细胞粘附的支架,在代替细胞外基质方面起着重要的作用,目前研究的神经组织工程支架材料主要有：天然生物材料、合成材料、化学修饰材料、复合材料、生物衍生材料及纳米材料等。鉴于以上因素,本实验选用骨髓基质细胞诱导得到的神经干细胞作为种子细胞与作为支架材料的基质胶(BD Biosciences, Matrigel)联合移植来观察对脑损伤的修复作用。种子细胞来源的不断丰富和组织工程支架材料的不断改进,推动干细胞移植疗法的发展,但是在应用干细胞疗法之前我们有很多问题需要解决,其中如何通过非侵入性的方法对干细胞在体内的迁移分化和功能情况等进行监测和评估就是其中之一,因为移植细胞和宿主细胞之间的相互作用和功能联系的机制还不甚清楚,而这些是我们把干细胞移植疗法应用于临床之前需要解决的问题,一种有效的非侵入性的评估干细胞移植疗法的方法对于我们制定临床策略和评价预后同样重要。在现有的多种方法中,神经影像学用于活体示踪是目前研究最热门的方法之一,主要包括磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)技术,核医学技术,荧光和生物发光技术等。通过纵向长期评价,而不需要处死动物,活体示踪能够更好的研究移植后细胞的迁移和移植细胞发挥作用的机制,这些不仅对于发展干细胞疗法有促进作用而且对于将来的临床应用有更大的实用价值。目前国内外的研究多是从结构上活体示踪移植干细胞的存活和迁移,如SPIO (Superparamagnetic iron oxide, SPIO)的应用等,但这些标记物结合影像学活体示踪无法从功能上追踪移植细胞在宿主神经组织内的功能状态,所以我们需要从功能上评估和示踪移植干细胞与宿主组织的功能整合。在功能成像研究方面,以往采用的FDG PET(F-fluoro-deoxy-D-glucose PET)及BOLD MRI(blood oxygenation level dependent MRI)方法只可提供区域脑组织活动的间接指标信息—脑局部糖代谢变化,尚难以直接反映神经功能活动变化,特别是尚无法在细胞水平上直接反映移植干细胞的功能活动。由此本实验组考虑应用活性诱导锰离子增强磁共振技术进行神经干细胞移植后功能恢复评估的前期研究。锰离子增强磁共振成像(manganese-enhanced MRI,MEMRI)技术,是一种功能磁共振成像技术。1997年,Lin YJ and Koretsky AP首次应用该技术进行大鼠电刺激前肢后脑功能成像,并阐述了MEMRI功能成像的原理：利用神经细胞发生电活动时电压依赖性钙离子通道开放,而锰离子作为钙离子的类似物、可以通过开放的电压依赖性钙离子通道进入细胞,加之锰离子是一种顺磁性物质,从而可以起到标记发生电活动的神经细胞的作用,使这些激活的区域获得磁共振增强效果,这基于其可以通过开放的电压依赖性钙离子通道进入神经细胞及在局部用药时可以沿神经束顺行传递这两方面特性,而且锰离子在神经功能活动发生时迅速进入激活的神经元后,在细胞内的清除期较长,锰离子可以在激活的神经元中持续增加聚集,这种锰离子显像时程累积效应将有助于从数以千万计的移植细胞中捕捉到更细微、更瞬时的神经元电活动,其既往应用主要包括神经功能成像、神经束成像和脑构筑成像等研究,近期也将其应用于神经系统疾病成像。鉴于大鼠视觉系统功能和解剖的确定性,以及国内外鲜见应用锰离子增强成像技术功能成像大鼠视觉皮层的研究,本实验中第二部分选择了视觉皮层为研究对象,尝试应用动态成像方法示踪大鼠视觉皮层的功能活动,为神经系统功能研究提供方法学上的支持。第一部分：骨髓源性神经干细胞联合基质胶对大鼠脑损伤的治疗作用目的：目前在修复脑损伤的研究中,关于干细胞和组织工程材料联合移植修复脑损伤的研究较少,尚鲜见有骨髓源性神经干细胞联合基质胶(Matrigel)修复脑损伤的研究,本实验主要探讨胞,并用bFGF、EGF和N2等诱导成骨髓源性神经干细胞,然后用荧光染剂DiI标记后移植。32只Wistar大鼠,随机分为4组：正常组,生理盐水组,单纯BMSC-D-NSCs移植组,BMSC-D-NSCs联合基质胶移植组。采用改良自由落体撞击脑损伤模型,损伤7天后采用损伤区移植,分别于细胞移植后1、7、14、21、28天进行动物行为学评分,移植4周后处死实验动物,相关组织学染色后,计算损伤所致空腔体积,分析移植细胞的存活和迁移情况,数据资料应用SPSS13.0软件进行分析,各组治疗后的体积比较采用单向方差分析；不同处理组在五个时间点的行为学评分采用重复测量数据的方差分析进行统计分析,P<0.05表示差异有统计学意义。结果：单纯BMSC-D-NSCs移植组和BMSC-D-NSCs联合Matrigel组在组织缺损体积方面较生理盐水组有显著减少,各组差异有统计学意义(P=0.000),且BMSC-D-NSCs联合Matrigel组较单纯BMSC-D-NSCs移植组损伤空腔体积显著减小,差异有显著性意义(P=0.000)；大鼠行为学评分,正常组评分一直稳定较低水平。经重复测量方差分析,结果显示组间差异显著(F=345.261,P=0.000),治疗组比不治疗组mNSS评分要低,治疗方法与时间之间有交互作用(F=20.193,P=0.000),提示不同治疗方法随时间的增加评分变化趋势不同。进一步分析单独效应,结果显示除1天外各时间点内各组间比较均有显著性差异(P均<0.05)。结论：BMSC-D-NSCs联合Matrigel移植组比单纯BMSC-D-NSCs移植组能更好的促进脑损伤的修复。第二部分：动态锰离子增强磁共振功能成像大鼠视觉皮层目的：虽然我们的前期研究表明,BMSC-D-NSCs联合Matrigel移植组比单纯BMSC-D-NSCs移植组能更好的促进神经功能恢复,但其在活体的功能情况仍不明了,本课题组拟采用动态MEMRI功能成像来研究BMSC-D-NSCs移植后在体内的功能情况,我们首先进行了一些成像方法上的初步研究,本部分用动态锰离子增强磁共振技术行大鼠视觉皮层功能成像,为神经系统功能研究提供方法学上的参考。方法：成年雄性Wistar大鼠6只,右颈外动脉插管后于连续的4个时段分别进行不同的处理,第一时段(5min)成像前不给予药物处理,无视觉刺激；第二时段(10min)成像前经右颈内动脉应用甘露醇开放血脑屏障和注射氯化锰,无视觉刺激；第三时段(15min)成像前仅给与氯化锰注射,给予视觉刺激；第四时段(5min)成像前注射氯化锰与谷氨酸混合液,无视觉刺激；每一时段处理后立即进行大鼠头颅磁共振成像,应用SPM软件进行图像的配准和平滑处理,应用Matlab软件得出图像的配色图及等高线图；选取视觉皮层进行兴趣区(Regions of interest,ROI)分析,观察不同处理后磁共振中脑内特异性增强区域并比较大鼠视觉皮层的信号强度,数据资料统计分析用SPSS13.0软件进行,应用配对t检验比较第二阶段和第三阶段的差异。结果：磁共振图像分析显示第一、二时段大鼠脑内未发现特异性增强区域,第三时段大鼠右侧视觉皮层特异性增强,第四时段大鼠右侧脑内多个核团特异性增强；ROI分析显示第三时段处理后的视觉皮层信号强度(1.897±0.172)明显强于第二时段(1.549±0.163),差异有统计学意义(P<0.05)。结论：本研究所采用的动态锰离子增强磁共振成像技术可用于分析大鼠视觉皮层功能活动,也为研究神经系统功能提供了新的方法。