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杜氏盐藻是一种高度耐盐的单细胞真核生物,有一对约13μm的等长双鞭毛,其具有典型的“9+2”结构,利用普通的理化手段即可调节鞭毛的再生和解聚。与模式生物莱茵衣藻相比,杜氏盐藻无细胞壁,结构上更接近哺乳动物细胞,且其结构简单,生长周期短易于培养,鞭毛形态及结构易于观察,所以非常适合作为研究鞭毛／纤毛长度调控机制的模式生物。鞭毛和纤毛是进化上保守的普遍存在于多种细胞表面的细胞器,它们的结构基本相同。鞭毛／纤毛内运输是定位在鞭毛／纤毛膜和轴丝之间的一种基于微管的运输机制。很多鞭毛／纤毛相关蛋白颗粒能够实现由驱动蛋白II所驱动的鞭毛底部到顶端的运输(即正向运输)和由动力蛋白所驱动的从鞭毛顶端到底端的运输(即逆向运输)。IFT蛋白(intraflagellar transport protein)对于真核细胞鞭毛／纤毛的装配和维护是必不可少的。IFT复合体包含20种以上IFT蛋白,可分为IFT-A和IFT-B。IFT88蛋白是IFT-B的成分之一,它是由IFT88基因所编码的,该基因属于(tetratricopeptide repeat, TPR)多肽重复序列家族成员,此重复序列能介导蛋白质之间的相互作用[1],对IFT88蛋白的运输功能起着极其重要的作用。在衣藻细胞内,IFT88能够与IFT52,IFT46和Hsp40相互作用,IFT88基因的缺失会导致鞭毛组装缺陷。在小鼠中,IFT88同源蛋白Tg737的突变会引起多囊肾疾病[2],且Tg737的突变与小鼠的视觉、嗅觉的功能障碍也有一定关系[3-4]。由于IFT88在鞭毛组装中的重要的作用,IFT蛋白在绿色藻类,线虫类和脊椎动物中都非常保守,并且IFT88在盐藻中的功能未见报道。本试验根据实验室盐藻鞭毛再生过程中的转录组测序片段(共591个核苷酸,在NCBI比对与衣藻IFT88mRNA片段有71%的同源性),通过3’和5’RACE扩增得到其cDNA全长,使用机械研磨法去除盐藻鞭毛后使盐藻鞭毛再生,分别用碘染[5-6]和银染[2]方法观察杜氏盐藻鞭毛的再生情况,并用实时荧光定量PCR检测了IFT88mRNA在鞭毛再生过程中的表达情况。随后利用ORF finder预测并扩增其开放阅读框(Open Reading Frame, ORF),构建了IFT88的原核表达载体并诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达。本试验利用盐藻作为模式生物来研究IFT88的功能,为进一步研究IFT88在细胞内的功能奠定基础。方法1杜氏盐藻IFT88基因全长的克隆根据本实验室盐藻转录组测序片段(共591个核苷酸,在NCBI比对与衣藻有71%的同源性),分别设计其3’内、外测引物及5’端内、外侧引物,3’RACE法,5’端PCR法扩增IFT88的cDNA序列,测序后使用DNAMAN拼接,最后验证所得序列。2杜氏盐藻IFT88的功能分析使用机械研磨法处理杜氏盐藻,使其脱去鞭毛,正常培养,使鞭毛发生再生,并分别用银染和碘染方法观察杜氏盐藻鞭毛。同时在再生过程中提取部分时间点杜氏盐藻总RNA；分别将提取的总RNA反转录为cDNA。根据实时荧光定量PCR引物设计要求,设计一对引物,以GAPDH基因作为内参,以反转录的杜氏盐藻cDNA作为模板,进行实时荧光定量PCR,在转录水平上研究杜氏盐藻IFT88基因在鞭毛再生过程中相对表达量的变化。3杜氏盐藻IFT88蛋白的原核表达将杜氏盐藻IFT88基因开放阅读框与原核表达载体pET28a(+)连接后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测IFT88蛋白表达情况。结果1杜氏盐藻IFT88基因全长的克隆克隆得到杜氏盐藻IFT88基因全长为3054bp,其中包括316bp的5’UTR、428bp的3’UTR以及2400bp的开放阅读框,共编码799个氨基酸残基。蛋白序列与多个物种的IFT88具有很高的同源性,其中与莱茵衣藻IFT88基因的同源性约为59%。2杜氏盐藻IFT88的功能分析通过碘染和银染对盐藻染色,在显微镜下观察到盐藻鞭毛再生过程中鞭毛长度的变化。实时荧光定量PCR结果显示杜氏盐藻IFT88mRNA的表达量在去鞭毛后30min左右时最高。与鞭毛生长速率基本一致。证明IFT88在杜氏盐藻鞭毛的再生过程可能起着非常重要的作用。3杜氏盐藻IFT88蛋白的原核表达聚丙烯凝胶电泳结果显示：与对照组相比,诱导组在90kDa左右有特异性条带出现,与预测的IFT88蛋白大小相同。结论1.克隆拼接得到杜氏盐藻IFT88基因全长为3054bp,其中包括316bp的5’UTR、428bp的3’UTR以及2400bp的开放阅读框,共编码799个氨基酸残基。2.IFT88在杜氏盐藻鞭毛的再生30min时表达量增加,说明其在鞭毛再生过程中可能起着非常重要的作用。3.成功诱导了IFT88在大肠杆菌中的表达,SDS-PAGE显示杜氏盐藻鞭毛内运输蛋白IFT88的分子量约为88kDa,为进一步制备抗体提供依据。