星星草耐盐分子机理研究及相关基因的克隆

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星星草是一种有较强耐盐碱能力的盐生植物,是进行植物耐盐碱机理研究的理想材料。为研究NaHCO3胁迫下星星草的耐盐机理,以450 mmol/L NaHCO3胁迫处理的星星草叶片为材料构建了cDNA文库,同时,用表达序列标签(EST)分析和cDNA表达谱芯片分析相结合的方法研究了NaHCO3和干旱胁迫下星星草基因的表达。 所构建cDNA初始文库的滴度为1.0×106 pfu/mL,文库的重组率为95%,PCR检测显示,插入片段的平均长度为0.8 kb。从文库中随机挑选3168个克隆进行测序,共获得2972条高质量的序列;通过序列的聚类分析共将1102条序列拼接为496个contig,其余1870条序列为单一序列,共获得2366条无重复的独立序列,它们的GenBank登录号为CN485355-CN487720。 从2366条序列中挑选660个cDNA经PCR扩增后作靶基因点样在玻片上制成cDNA芯片。将对照、NaHCO3和干旱处理的星星草总RNA,经荧光染料Cy5-dCTP和Cy3-dCTP标记后制成cDNA探针,与cDNA芯片进行杂交。 2366个序列的BLASTX分析结果显示,共有1274条序列与已知基因序列高度同源,618条为与已知基因同源性较低,其余474条序列与已知基因无任何同源性。将1274条与已知基因同源的序列按功能分为12类,其中代谢、转录调节、功能未知及细胞防御相关四类基因的表达丰度最高,分别占已分类EST总数的18.84%、12.48%、11.22%和9.66%。对高丰度表达基因和162条可能与耐盐相关基因的分析表明,光合作用、转录调节、转运蛋白和细胞防御4类基因的表达丰度较高,说明光合作用、水分和离子的转运、耐盐基因的表达调控、活性氧等毒性物质的去除等过程在星星草抗盐胁迫时起到了重要作用。cDNA芯片研究NaHCO3胁迫下星星草基因表达结果显示,共有25个基因在盐胁迫处理前后差异表达,其中17个基因在盐胁迫下表达下调,8个基因在盐胁迫下表达上调,这些基因的功能主要涉及了信号传导与转录调控、细胞防御、细胞代谢3个方面,这些差异表达的基因可能在星星草抗盐过程中具有重要作用。cDNA芯片研究干旱胁迫下星星草基因表达,共发现下调表达的基因24个,上调表达基因18个。差异表达基因的功能主要涉及了信号传导、转录调控、逆境响应等方面。通过以上研究,初步建立了NaHCO3、干旱胁迫前后星星草基因的表达谱。 植物的抗盐过程是一个复杂的多基因协同作用的体系。以上研究说明,通过EST技术和cDNA芯片分析等基因组学研究手段的应用,可有效获取盐胁迫下星星草众多基因的表达特征信息,从而为系统阐明星星草抗盐碱分子机理奠定坚实的基础。
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