本文以植酸为原料,采用酶法和非酶法水解植酸制备了具有生理活性的三磷酸肌醇。研究了不同来源的植酸酶的酶学性质,植酸的水解条件,三磷酸肌醇分离纯化方法,不同方法制备的三磷酸肌醇的结构,并对三磷酸肌醇体内外抗氧化,体内对S₁₈₀肿瘤生长的抑制作用和对荷瘤小鼠免疫能力的影响,体外对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用及其对糖尿病小鼠的治疗作用进行了研究。主要结果如下: 1 土曲霉植酸酶与小麦麸皮植酸酶酶学性质的研究 通过钼锑抗法测无机磷,并以此为基础建立了植酸酶酶活测定方法。 土曲霉植酸酶反应最适条件为pH5.10,温度50℃,底物浓度为5mmol/L。钙、镁离子对该酶有激活作用,而无机磷对酶活有抑制作用,10mmol/L的无机磷对该酶的抑制作用为27%。土曲霉植酸酶的米氏常数Km为0.0528mmol/L。土曲霉植酸酶酶活达1.48*10⁵U/g。 小麦麸皮植酸酶反应最适条件为pH5.15,温度37℃,底物浓度为2.5mmol/L,钙、镁离子对该酶有激活作用,而无机磷对酶活有抑制作用,当磷酸根离子浓度达到10mmol/L时,酶活有24%被抑制。小麦麸皮植酸酶的米氏常数Km为0.266mmol/L,酶活为1.8U/g麸皮。从麸皮中提取植酸酶时,最佳提取条件为麸皮与水的质量比为1:6,提取温度为5℃,时间为2h。小麦麸皮植酸酶在储存时应在低温进行,37℃放置16h后,酶活只有刚透析出来的酶的酶活的83.2%。 2 三磷酸肌醇的制备与分离 植酸在小麦麸皮植酸酶最适水解条件下水解,当水解度达到50%时,水解混和液上717型强离子交换树脂,0.05～0.7M盐酸梯度洗脱,洗脱物分别取样消化,检测无机磷含量变化,并将同一峰值部分收集在一起,用NaOH中和,加CaCl₂溶液,产生沉淀,过滤,沉淀用HCl溶解,上732型阳离子树脂脱去钙离子,蒸馏水洗脱,洗脱液用NaOH中和至中性后,减压浓缩,冷冻干燥制得InsP3。用HPLC方法证明InsP3中无其他低磷酸肌醇,收率为28.4%。所得InsP3进一步用阴离子交换树脂分离,得到了两个InsP3组分。 植酸经土曲霉植酸酶水解,水解产物经同样方法处理,当水解度为50%,收率为26%。所得InsP3进一步用阴离子交换树脂分离,得到两个InsP3组分。 用微波辐射方法水解植酸,当水解度为50%,InsP3收率为18.4%。 由小麦麸皮植酸酶、土曲霉植酸酶、微波辐射方法制得的InsP3分别被命名为InsP3A、InsP3B、InsP3C。 3 三磷酸肌醇的结构分析