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研究目的:脊髓损伤(spinal cord injuries,SCI)是中枢神经系统创伤性疾病,具有高发病率,高致残率,目前尚无有效治愈的方法。本课题组前期研究发现自体激活雪旺细胞(SCs)不仅能分泌神经营养因子,抑制神经元凋亡,还可以诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元方向分化,促进轴突再生和功能恢复,但具体的激活及诱导机制尚不清楚。本课题应用iTRAQ(Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation)技术深入研究BMSCs与SCs共培养后的蛋白质组学变化,建立其差异蛋白谱,寻找参与细胞移植干预修复的潜在细胞信号转导通路,确立细胞信号通路中关键调节位点的改变和调控方式,进一步明确BMSCs与SCs共移植的修复SCI机理。研究内容与方法:本课题应用采用胰酶消化组织块和机械分离法培养雪旺细胞,同时应用胰酶快速消化法和双30分钟差速贴壁法纯化SCs。用改进的全骨髓贴壁法,分离培养大鼠BMSCs。应用S100免疫荧光染色鉴定SCs,应用流式细胞仪和三系分化鉴定BMSCs。本实验共分为3组,单纯BMSCs组(SC0),BMSCs与SCs共培养3天组(SC3),BMSCs与SCs共培养7天组(SC7)。本实验采用半定量换液的方式进行共培养。应用裂解液提取法提取各组蛋白,应用2D Quant试剂盒测定每组蛋白浓度,采用iTRAQ/TMT质谱定量方法鉴定差异蛋白。应用Mascot软件对二级谱图信息进行定性定量计算。对差异蛋白分别进行GO、KEGG、Interpro功能的注释与功能分析,对差异蛋白进行显著性富集分析,应用STRING数据库对差异蛋白进行网络互作关系分析。研究结果:本实验以表达上调或下调1.3倍以上作为差异表达蛋白。SC3d组与SC0d组相比,上调蛋白29个,下调蛋白45个;SC7d组与SC0d组相比,上调蛋白43个,下调蛋白32个;SC7d组与SC3d组相比,上调蛋白83个,下调蛋白24个。对差异表达蛋白进行GO注释和亚细胞定位分析显示:差异表达蛋白共涉及13种生物过程,9种细胞组份,9种分子功能;主要位于细胞核、细胞质、胞外蛋白,质膜等亚细胞结构中。对鉴定的差异表达蛋白进行蛋白功能(GO/level2)、功能结构域、KEGG Pathway富集分析显示,发现SC3d vs.SC0d比较组的差异表达蛋白显著富集的功能term相对较少,SC7d vs.SC0d组差异蛋白主要富集在脂类代谢、糖类代谢,生物降解等生物过程,显著富集在溶酶体、细胞骨架和细胞外基质等细胞组份中,显著富集在水解酶活性,糖胺聚糖结合和糖类结合等分子功能中,3个比较组差异蛋白显著富集的代谢通路为鞘糖脂生物合成代谢,神经鞘脂类代谢,溶酶体代谢途径,显著富集的功能结构域为糖苷键键水解酶催化结构域,钙调蛋白同源结构域,糖基水解酶家族13。基于对各组差异蛋白GO(三个本体)、KEGG和Interpro共五项功能富集分析的结果cluster分析显示,总共54个生物过程term得以聚类,38个细胞组份功能term得以聚类,38个分子功能term得以聚类。KEEG聚类分析主要集中在SC7 vs.SC3比较组,主要为神经节鞘磷脂生物合成代谢、溶酶体代谢途径、鞘磷脂代谢途径等,功能结构域聚类分析同样主要集中在SC7 vs.SC3比较组,主要为硫酸酯酶、糖苷水解酶催化结构域、糖苷水解酶超家族等结构域。结论:本研究应用定量蛋白组学技术,绘制了BMSCs与SCs共培养后的差异蛋白表达谱,为揭示BMSCs与SCs共移植到脊髓损伤部位发挥作用的深层机制奠定了一定的基础,对于这些问题的研究将有助于深化和扩大干细胞临床治疗应用。