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研究背景:肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是常见的成人泌尿系统恶性肿瘤。最新的流行病学资料显示,RCC发病率约占所有恶性肿瘤的3.8%,死亡率则高达24%,且其发病率以2%至4%的幅度逐年上升。肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是RCC最常见和最具侵袭性的一种病理类型,占所有RCC病例的80~90%。ccRCC的发病机制尚不清楚,约30%的患者在就诊时即已发展至肿瘤晚期并多数伴有癌细胞转移,导致预后不良。由于ccRCC抵抗化疗和放疗,目前手术切除仍是治愈ccRCC的主要手段。临床数据表明,早期ccRCC患者经手术切除后5年生存率高达75%,因此实现ccRCC的早期诊断具有极大的临床意义。然而,目前尚无具有早期诊断价值的非侵入性血清学指标。因此,寻找ccRCC的无创性早期标志物以实现早期诊断、早期治疗迫在眉睫。外泌体是不同类型的细胞在正常和病理条件下主动分泌的30-150 nm囊泡,且在循环体液中能够稳定存在。外泌体通过传递生物活性分子(包括信号肽,脂质和核酸)在细胞间通讯中发挥关键作用,特别是通过携带微小核糖核酸(micro RNA,miRNA)参与疾病的进展。miRNA是长度为19-24个核苷酸的小非编码RNA,通过转录后调节机制抑制靶基因表达或促使靶基因降解。miRNAs与多种病理活动尤其是肿瘤密切相关。最新研究发现,ccRCC患者尿液中的一些外泌体miRNAs显著升高,表明其作为ccRCC无创性尿液诊断生物标志物的潜能。然而,ccRCC患者血清外泌体miRNAs的表达及其临床意义鲜有报道。目的:通过分析ccRCC患者血清外泌体miRNAs水平变化,筛选出ccRCC患者中稳定上调的miRNAs,评价其对ccRCC诊断价值尤其是早期诊断价值。方法:选取126例未经任何治疗的ccRCC患者的血清外泌体作为研究标本,同时收集124例年龄、性别相匹配的正常人的血清外泌体作为对照。首先应用纳米颗粒跟踪分析技术(nanoparticle tracking analysis,NTA)和蛋白免疫印迹技术(western blotting,WB)分别对外泌体的大小和特征蛋白进行检测和鉴定。其次运用低密度芯片技术(Taq Man low density array,TLDA)对两份分别来自20例ccRCC患者和20例正常对照组成的混合血清样本中的768种miRNA的表达量进行测定,初筛与正常人相比在ccRCC样本中表达明显升高的miRNAs。然后运用实时荧光定量PCR技术(quantitive realtime PCR,q RT-PCR)对初筛的miRNAs在复筛组(27例ccRCC和26例正常血清)进行个体验证,筛选出在患者样本中显著升高的miRNAs。进一步运用q RT-PCR技术在验证组(72例ccRCC和72例正常人)进行验证,以获得在ccRCC中稳定升高的一组miRNAs。另外,在测试组中(从另一个医院收集的病例样本组成)包括27例ccRCC和26例正常对照,对筛选出的miRNAs进行再验证。此外又在40例ccRCC患者术后样本中对筛选出的miRNAs进行检测。最后通过ROC曲线、Risk score分析和Logistic回归分析评价miRNAs及miRNA组合的临床诊断价值。结果:NTA结果显示,外泌体直径在100 nm左右,与报道一致。WB结果发现,在提取的外泌体中检测到特异蛋白标志物CD63和CD9的表达。低密度芯片结果显示,ccRCC患者血清外泌体中miRNA的表达谱与正常对照有显著差异,与正常对照相比,23种miRNA在ccRCC中表达明显上调(变化倍数>50),从中选取6种循环阈值(cycle threshold,Ct)<30的miRNA(包括miR-28-3p、miR-200a、miR-1826、miR-103、miR-1249和miR-640)进一步分析。q RT-PCR技术在复筛组中对6种miRNA进行个体验证,结果表明,这6种miRNA在ccRCC中的表达水平均显著高于正常对照(变化倍数为2.90~11.43倍,P<0.05)。在验证组和测试组进一步验证发现,6种miRNA在ccRCC中均显著且稳定升高(变化倍数分别为1.71~3.44倍,P<0.05;2.17~8.24倍,P<0.05)。早期ccRCC中6种miRNA的表达水平也均显著高于正常对照。另外对其中40例患者术前、术后样本进行比较,结果显示,6种miRNA的表达水平在患者术后均显著降低。ROC曲线下面积(area under the ROC curve,AUC)分析显示,6种miRNA在复筛组、验证组、测试组中的AUC范围分别是0.751~0.893、0.620~0.808、0.744~0.920。其中miR-1826在三组的AUC最大,分别是0.893(95%CI=0.807~0.979),0.808(95%CI=0.738~0.879),0.896(95%CI=0.813~0.979)。根据Risk score分析对6种miRNA进行各种组合比较发现,6-miRNA组合的AUC具有较高的诊断准确性,在复筛组、验证组和测试组中分别是0.751(95%CI=0.619~0.884)、0.804(95%CI=0.729~0.878)、0.887(95%CI=0.791~0.984),优于其他miRNA组合。根据选定的最佳cut off值,6-miRNA组合在复筛组、验证组和测试组中的阴性预测值(negative predictive value,NPV)和阳性预测值(positive predictive value,PPV)分别为73%和73%、72%和75%、92%和92%。此外,6-miRNA组合早期诊断的AUC为0.832(95%CI=0.774~0.889),根据选定的cut off值,6-miRNA组合对ccRCC早期诊断的NPV和PPV分别是77%和73%。逻辑回归分析显示,6种miRNA及6-miRNA组合的OR值均具有统计学意义。结论:ccRCC患者血清miRNA表达谱与正常对照有明显差异。6种miRNA(miR-28-3p、miR-200a、miR-1826、miR-103、miR-1249和miR-640)在ccRCC患者术前样本中的含量显著高于正常对照,并于ccRCC的早期阶段即已表现出明显的上升趋势,且在患者术后显著下降。6-miRNA组合对ccRCC早期诊断、手术效果评估方面具有较高的准确性,有望成为ccRCC潜在的液体活检指标。