抗重金属铬离子单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立

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重金属铬具有肝脏、肾脏、生殖、遗传、致癌等毒性作用。利用免疫分析技术检测重金属铬离子是近年来新型的检测分析方法,具有省时、省力、易于操作、携带方便、检测费用低等优点,逐渐替代了传统的理化检测方法。本文在重金属三价铬离子免疫原性分析基础上,合成了重金属铬离子人工抗原并进行了鉴定,制备出了单克隆抗体并进行了免疫学特性鉴定,建立了阻断ELISA检测方法并进行了性能测定。用异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)螯合Cr3+形成Cr3+-ITCBE螯合物半抗原,通过异硫氰酯法将该半抗原连接到牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)上制备成出人工免疫原Cr3+-ITCBE-BSA和人工包被原Cr3+-ITCBE-OVA。通过紫外分光光度法、SDS-PAGE电泳、电感耦合等离子体原子发射光谱法和免疫小鼠后抗血清的ELISA鉴定:Cr3+-ITCBE-BSA和Cr3+-ITCBE-OVA的蛋白浓度分别为5.80mg/mL和7.69mg/mL,Cr3+含量分别为140.08μg/mL和175.40μg/mL;间接ELISA效价达到1∶5.12×104,阻断ELISA检测Cr3+-EDTA的半数抑制浓度(IC50)为28.81ng/mL,除与Mo6+-EDTA具有较强交叉反应外,与EDTA及其它金属离子螯合物无交叉反应。用Cr3+-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠5只,5次免疫后用间接ELISA和阻断ELISA选择出细胞融合备用小鼠1只,应用细胞融合技术筛选出2A3C11、2A3D9、2A3E5、2A3F2、2A11G5共5株敏感特异的杂交瘤细胞,用体内诱生腹水法制备Cr3+EDTAmAb,经鉴定,其间接ELISA效价细胞培养上清分别为1∶2.56×103、1∶1.28×103、1∶2.56×103、1∶3.2×102、1∶2.56×103,腹水分别为1∶1.28×105、1∶2.56×105、1∶2.56×105、1∶1.28×105、1∶5.12×105,同种型间接ELISA检测试剂盒检测结果:5株杂交瘤细胞分别为IgG1/κ、IgG2a/λ、IgG1/λ、IgG2a/κ、IgG1/κ,2A11G5亲和常数(Ka)为2.69×10(9L/mol),其中亲和力最高的2A11G5株阻断ELISA测定其IC50为25.12μg/L,与Mo6+-EDTA的交叉反应率为22.13%,与其它金属离子螯合物无交叉反应。本试验制备的Cr3+-EDTA pAb和Cr3+-EDTA mAb均可用于Cr3+污染检测的免疫学试验,Cr3+-EDTA mAb效果更好。应用Cr3+-EDTA mAb组装出Cr3+污染快速检测阻断ELISA试剂盒(Cr3+Kit),Cr3+Kit的标准曲线呈S型,符合4参数logit曲线拟合,试剂盒检测灵敏度为3.23μg/L,检测限为5.0μg/L,线性检测范围为5.0~512.0μg/L;饲料样、猪尿样、猪血清样、自来水样的平均添加回收率分别为85.97%、84.18%、81.13%和90.21%,平均批内和批间变异系数均小于15%;Cr3+Kit与Mo6+的CR%为25.43%,与其它金属离子螯合物无CR。不同生物基质对Cr3+Kit的检测结果影响不大;Cr3+Kit在4℃可保存至少6个月。
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