目的:放射治疗（radiotherapy,RT）,俗称放疗,是传统治疗肿瘤的三大主要方法之一,约70%的肿瘤患者在病程中需要接受放疗。与化疗相比,放疗具有系统副作用相对较少的优点,在治疗未切除的肿瘤和预防手术后局部复发等方面是有效的治疗手段。众所周知,RT可以通过损伤DNA进而导致肿瘤细胞死亡。然而,一些研究表明,免疫系统在辐射场中可促进肿瘤细胞死亡。目前,人们逐渐认识到肿瘤放疗疗效在很大程度上受到宿主免疫状态的影响。现有的研究发现,辐射场内的免疫细胞在促进肿瘤细胞死亡中起着至关重要的作用。放疗已被证明对免疫应答发挥有益的调节作用,如诱导细胞DNA损伤和凋亡、触发免疫原性细胞死亡,增强抗原递呈,激活细胞毒性T细胞进而改变肿瘤微环境中关键免疫细胞的特性等。因此,放疗与免疫治疗的有效结合已成为当前肿瘤综合治疗研究中的重要内容。近年来,癌症免疫治疗取得了重要的突破,特别是免疫检查点阻断疗法,包括过继T细胞转移、树突状细胞疫苗、多肽疫苗、溶瘤病毒、细胞因子治疗、激动剂单克隆抗体、拮抗剂单克隆抗体和小分子药物等。免疫检查点阻断疗法可有效的抑制肿瘤生长,极大地改变了癌症患者的预后。迄今为止,靶向程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein-1,PD-1）、程序性死亡受体配体1（programmed cell death protein ligand 1,PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4的免疫检查点抑制剂已经成为许多基础研究和临床试验的焦点,在部分癌种中取得一定成效。然而,癌症患者对免疫检查点封锁的反应差异很大,在部分患者获得临床反应的同时,大多数患者获益极小或对免疫检查点封锁完全没有反应,部分有效的患者在获得短暂的肿瘤控制后出现肿瘤进展。因此,研究人员正在探索多模式的治疗方法,将免疫检查点封锁治疗与传统癌症治疗手段相结合,以提高对肿瘤的控制。越来越多的临床前研究和临床观察表明,放疗可能对增强免疫检查点抑制剂的疗效具有强大驱动力,因为放疗能够有效的激活抗肿瘤免疫反应并克服肿瘤的耐药性。现有资料表明,免疫治疗与放疗相结合可以更好地控制局部和全身肿瘤。然而,无论是内在的还是后天形成的,治疗抗性仍然是普遍存在的。因此,开发新的放疗联合免疫检查点抑制剂的治疗措施是十分必要的。T细胞免疫球蛋白与免疫酪氨酸为基础的免疫抑制结构域（T cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain,TIGIT;也称为WUCAM,Vstm3,VSIG9）是脊髓灰质炎病毒受体（poliovirus receptor,PVR;也被称为CD155、Necl5和Tage4）/Nectin家族的成员,该家族是免疫球蛋白超家族的一个子集。TIGIT的表达较严格的局限于淋巴细胞,在调节性和效应性CD4+T细胞、辅助性CD4+T细胞、效应性CD8+T细胞和自然杀伤细胞上表达最多。通过对分泌蛋白的筛选,发现CD155是TIGIT的高亲和性同源配体。由于CD155及TIGIT在肿瘤及免疫细胞表达的广泛性,CD155/TIGIT通路可能在整个癌症免疫周期中发挥重要作用。阻断CD155/TIGIT通路在多种临床前肿瘤模型中取得较好的抗肿瘤效果。同时,有关阻断CD155/TIGIT通路的临床实验也已陆续展开,并取得一定成绩,尤其是联合阻断PD1/PD-L1通路时。据我们所知,阻断CD155/TIGIT通路能否提高放疗对肿瘤的控制仍然是未知的。因此,本研究首先通过免疫组化染色评价CD155/TIGIT在临床样本中的表达情况,分析其表达情况对接受放疗患者预后的影响,评价该信号通路在肿瘤患者预后中的价值;其次,通过实验研究探索放疗对CD155/TIGIT表达的影响,评价放疗是否通过上调该通路抑制免疫细胞活性从而介导放疗抵抗;最后,通过构建荷瘤小鼠模型,评价通过抗TIGIT抗体阻断该信号通路联合放疗能否产生协同抗肿瘤作用,探索放疗与抗TIGIT治疗的相互作用机制,为开发新的联合治疗模式提供理论和实验基础。研究方法:1、收集114例原发性小细胞食管癌（primary small cell carcinoma of the esophagus,PSCCE）患者的临床病理资料及治疗前的病理组织切片。通过免疫组织化学染色评价PSCCE患者肿瘤及癌旁组织中CD155及TIGIT表达情况,评价CD155及TIGIT表达与临床病理因素的相关性,通过单因素方差分析及多因素方差分析评价CD155及TIGIT表达水平对患者预后的影响。在多因素分析基础上,构建列线图（Nomogram图）。并通过一致性指数（concordance index,C-index）和校准图评价Nomogram图的预测性能。采用决策曲线分析（decision curve analysis,DCA）法评价列线图的净获益。2、通过公共数据库（Kaplan-Meier plotter数据库、基因表达谱交互分析数据集和EMBL-EBI表达图谱数据库）分析CD155在肿瘤细胞表达及对临床预后的影响。收集118例接受根治性放化疗及49例接受新辅助放化疗（neoadjuvant chemoradiotherapy,n CRT）的食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）患者临床病理资料,获取放疗前内镜活检及手术后肿瘤组织病理切片。通过免疫组织化学法评价CD155表达情况,分析治疗前肿瘤活检样本CD155表达对接受放疗患者预后的影响,比较放疗前后患者肿瘤样本CD155表达差异。3、采用免疫印迹（western blot,WB）实验分析人源肺癌细胞系、人源食管鳞状细胞癌细胞系及食管癌放疗抵抗细胞系CD155的表达情况,评价放疗对CD155表达的影响。通过小干扰RNA沉默靶基因、WB、双荧光素酶等实验技术探索放疗调节CD155表达的潜在机制。通过CRISPR/Cas9技术构建CD155敲除的鼠源结肠癌细胞系（MC38）;在体外,通过细胞增殖和毒性实验（cell counting kit-8,CCK-8）、克隆形成、细胞凋亡等实验方法评价CD155表达对肿瘤放疗敏感性的影响;在体内,建立免疫缺陷及免疫功能正常荷瘤小鼠模型,进一步评价CD155表达对肿瘤放疗敏感性的影响。4、对23例接受n CRT的ESCC患者放疗前后肿瘤组织样本进行多重免疫荧光染色,首先评价肿瘤组织浸润的CD8+T细胞、CD4+T细胞及NK细胞在放疗前后数量的差异,同时比较TIGIT在CD8+T细胞、CD4+T细胞及NK细胞上的表达在接受放疗后的变化,评价TIGIT表达水平对ESCC患者接受n CRT后临床病理缓解的影响。建立MC38、LLC及B16 F10荷瘤小鼠模型,通过比较肿瘤生长曲线、生存曲线及对远隔肿瘤控制的差异评价抗TIGIT治疗对放疗疗效的影响。通过建立野生型和Batf3缺陷(Batf3-/-)荷瘤小鼠模型,评估CD103+树突状细胞（dendritic cells,DCs）在放疗联合抗TIGIT治疗中发挥协同抗肿瘤作用的潜在价值。联合Fms样酪氨酸激酶3配体（fms-related tyrosine kinase 3 ligand,Flt3L）治疗用于进一步证实CD103+DCs在放疗联合抗TIGIT治疗中的作用。结果:1、通过免疫组化评分,我们发现CD155和TIGIT在PSCCE肿瘤组织中常呈过表达;CD155的表达水平与TIGIT表达呈正相关（P<0.001）,同时CD155与肿瘤大小、T分期、远处转移、TNM分期和Ki-67评分显著相关（P<0.05）。TIGIT的表达与肿瘤大小、T分期、远处转移和TNM分期相关（P<0.05）。高表达CD155和TIGIT的患者其总生存期（overall survival,OS）和无进展生存期（progression free survival,PFS）明显较低表达患者短。多因素回归分析显示CD155表达和治疗策略是PSCCE患者的独立预后因素。在Nomogram模型构建后的验证步骤中,OS被很好地校准（C-index=0.724）,DCA证明该模型具有令人满意的临床应用效能。总之,我们的研究结果显示,CD155和TIGIT在PSCCE患者中高表达,且与较短的OS和PFS相关,可作为预测患者生存和放疗疗效的生物标志物。2、通过Kaplan-Meier plotter数据库分析发现,在接受放射治疗的肺癌患者中,高表达CD155的患者往往具有较差的OS和PFS。通过对接受根治性放疗的ESCC患者分析,我们发现CD155低表达患者的OS显著高于CD155高表达患者,PFS也获得了类似的结果。通过对CD155表达进行免疫组化染色评分,我们发现在接受n CRT的ESCC患者中,CD155高表达与放疗后肿瘤回归分级（tumor regression grading,TRG）较高相关,预示对放疗反应较差。我们通过基因表达谱交互分析数据集和EMBL-EBI表达图谱数据库分析发现,CD155在肿瘤组织及细胞系常常呈过表达（96.9%）。我们对常见的肺癌及食管癌细胞系行WB分析发现,有5个肺癌（5/7）和4个ESCC（4/6）细胞系CD155蛋白水平显著高表达。上述实验发现进一步证实CD155在肿瘤细胞中常呈高表达。3、放疗可显著增加肺癌细胞系H1299、SPCA-1 CD155的表达,放疗抵抗ESCC细胞系（KYSE 150R、KYSE 30R）CD155表达水平显著高于野生型细胞。放疗增加了接受n CRT ESCC患者肿瘤组织CD155的表达。q PCR及WB分析发现,放疗后小鼠LLC及MC38细胞CD155蛋白水平略有上调,但m RNA水平显著升高。机制上,放疗可增加Rel B入核,促使CD155 m RNA转录增强。双荧光素酶实验证实Rel B与CD155启动子区域存在结合位点。体外实验证实,CD155敲除可增加放疗后细胞凋亡、细胞存活率降低、克隆形成能力下降。通过建立裸鼠肿瘤模型发现,CD155敲除联合放疗较单纯放疗相比,肿瘤生长得到进一步抑制。此外,免疫功能正常的荷瘤小鼠模型证实CD155敲除联合放疗较单纯放疗相比,肿瘤生长得到更加明显的抑制。4、通过对肿瘤组织进行多重免疫荧光染色,我们发现放疗可以显著增加肿瘤浸润CD8+T细胞及NK细胞的数量;此外,放疗后TIGIT在CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞表达也显著上调。在荷瘤小鼠模型中,肿瘤及肿瘤引流淋巴结中淋巴细胞TIGIT表达亦明显增高。通过荷瘤小鼠模型研究发现,抗TIGIT治疗可以增加放疗对原发肿瘤及远隔肿瘤的控制,延长荷瘤小鼠的生存期,建立了特异性免疫记忆效应。机制上,放疗联合抗TIGIT治疗的协同抗肿瘤效应主要通过增加CD8+T细胞在肿瘤中的浸润以及增加CD8+T细胞TNF-α和IFN-γ的分泌。在Batf3-/-小鼠模型中发现,放疗联合抗TIGIT治疗的抗肿瘤效果被抵消,说明放疗联合抗TIGIT治疗需要CD103+DCs以促进对肿瘤的控制。此外,Flt3L治疗增强了肿瘤对放疗联合抗TIGIT治疗的反应。结论:1、CD155和TIGIT在PSCCE患者中高表达,并与较短的OS和PFS相关,同时CD155高表达预示较差的肿瘤病理缓解率,支持CD155及TIGIT作为肿瘤预后标志物的作用。2、放疗可通过上调CD155/TIGIT表达,介导肿瘤免疫逃逸,降低对放疗的敏感性。3、阻断CD155/TIGIT信号通路可通过影响肿瘤细胞本身及肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞活性增加放疗敏感性,提高放疗疗效。4、放疗联合抗TIGIT治疗疗效依赖于CD103+DCs,提示靶向TIGIT通路并增加CD103+DCs组织浸润在提高放疗疗效中的临床应用潜力。