Angiopep-2-EGFP对神经胶质瘤细胞的靶向性及脂质体的10B导入效率研究

来源 :大连医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zslovechl
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背景:神经胶质瘤是一种恶性度很高的脑部肿瘤,具有浸润性强,复发率和病死率高等特点。神经胶质瘤对放疗具有很高的拮抗性,同时血脑屏障(Blood Brain Barrier,简称BBB)的存在又使得化疗药物不能以有效的治疗浓度到达肿瘤部位,也增加了神经胶质瘤的治愈难度。因此传统的放、化疗均不能达到预期的治愈效果,对于神经胶质瘤而言,探索新型的治疗方法势在必行。Angiopep-2(TFFYGGSRGKRNNFKTEEY)是近年来脑肿瘤靶向治疗研究的热点,其主要通过血脑屏障上的低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)介导内吞进入脑组织。相关研究表明:Angiopep-2具有血脑屏障和胶质瘤双靶向能力,这为神经胶质瘤的靶向治疗提供了新的途径。硼中子俘获治疗(Boron Neutron Capture Therapy,简称BNCT)是一种新型的脑肿瘤治疗手段,细胞内是否含有足够量的10B和超纯度的热中子是BNCT成功的关键。BNCT中,利用对人体无毒副作用,而对癌细胞有很强亲和力的硼载体将硼靶向运输并聚集于癌细胞内。当肿瘤组织的10B浓度达到有效的治疗浓度时(20-30 μg 10B/g),利用热中子进行照射,热中子与进入癌细胞内部的10B发生强烈的核反应,进而产生α粒子。α粒子具有极强的杀伤性,但其射程却极短,所以在有效杀死肿瘤细胞的同时又不会损伤肿瘤细胞周围的正常组织,对浸润性的脑肿瘤而言,是一种非常有效的治疗方式。目的:1.构建融合蛋白Angiopep-2-EGFP(以下简称ANG-E)原核表达载体,并对融合蛋白进行表达、纯化;ANG-E对人原代星形胶质细胞和不同神经胶质瘤的靶向性检测。2.ANG-E修饰的脂质体硼载体对不同神经胶质瘤细胞10B导入效率的分析及神经胶质瘤细胞中子照射后的基因和蛋白变化。3.构建裸鼠脑肿瘤模型,分析ANG-E修饰的脂质体硼载体对荷瘤裸鼠的10B导入效率。方法:1.根据Angiopep-2基因序列合成相应引物,PCR反应得到ANG-E基因,并将其连接到pET-22b(+)表达载体上,在大肠杆菌BL2(DE3)或Rosetta(DE3)中进行原核表达,并利用组氨酸亲和层析柱(His.Bind Column)进行纯化;激光共聚焦显微镜(LSCM)检测ANG-E对人原代星形胶质细胞和不同神经胶质瘤细胞的靶向性。2.纳米粒度和Zeta电位分析仪以及激光粒度仪检测构建的DSPC/DSPE脂质体硼载体的粒径和Zeta电位,电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)检测脂质体包封率、ANG-E修饰的脂质体硼载体的体内、体外硼导入效率;CCK-8检测ANG-E修饰的脂质体硼载体的细胞毒性;Real Time PCR(qPCR)检测BNCT后p53基因RNA含量变化,Western Blotting检测中子照射后p53蛋白的表达量变化。3.HE染色鉴定裸鼠脑肿瘤模型的建立。结果:1.成功构建了 ANG-E表达载体,并得到纯化的蛋白;ANG-E对神经胶质瘤细胞具有良好的靶向性,对人原代神经胶质细胞不具有靶向性;2.CCK-8实验表明ANG-E修饰的脂质体硼载体对细胞无毒副作用;ICP-AES检测结果显示经融合蛋白修饰的硼载体的硼导入效率显著提高,在12h达到峰值,不同时间点的硼导入量均满足BNCT的最低要求;中子照射后,U87MG细胞的p53基因和蛋白表达量均明显增高。3.HE染色结果表明裸鼠脑神经胶质瘤模型构建成功,经ANG-E修饰的脂质体硼载体对荷瘤小鼠的10B导入效率显著提高。结论:1.ANG-E对人原代星形胶质细胞基本不具有靶向性,而对不同的神经胶质瘤细胞U251、U87MG、paU87以及U87△EGFR细胞均具有良好的靶向性。2.ANG-E融合蛋白修饰的硼载体对不同神经胶质细胞的硼导入效率均满足BNCT的最低要求。3.中子照射后,神经胶质瘤细胞U87MG中的p53基因含量和P53蛋白表达量均明显提高。4.ANG-E修饰的脂质体硼载体能高效地将10B导入荷瘤小鼠的肿瘤中。
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