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第一部分大鼠蛛网膜下腔出血后脑组织中Cyclophilin A、CD147的表达变化目的探讨大鼠蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage,SAH)后亲环素A(Cyclophilin A,CyPA)、白细胞分化抗原147(Cluster of differentiation 147,CD147))的表达变化与早期脑损伤(Early brain injury,EBI)的关系。方法1、实验动物分组:72只健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为6组,每组12只,分别为假手术组和5个SAH组,SAH组分为SAH后2小时,12小时,24小时,48小时和72小时五个亚组。2、动物模型制作:应用视交叉前池注血建立实验性蛛网膜下腔出血动物模型。在各个时间点处死大鼠、灌注取脑并且留取颞底脑标本检查。3、检测方法及指标:通过免疫荧光和蛋白印迹(Western-blot,WB)法评估大鼠蛛网膜下腔出血后后不同时间点的颞底脑组织中CyPA、CD147的表达变化。结果1、Western-blot结果显示,与假手术组相比,大鼠蛛网膜下腔出血后12小时CyPA和CD147在脑组织中的表达开始增高(P<0.05),并且在蛛网膜下腔出血后24小时表达达到高峰(P<0.01),随后开始下降,但在SAH72小时时,CyPA和CD147的蛋白表达水平仍明显高于假手术组(P<0.05)。2、免疫荧光共染结果显示CyPA和CD147在颞底神经元中的表达趋势与Western-blot结果类似。结论1、cypa、cd147可能参与蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的病理过程。2、蛛网膜下腔出血后24小时可能是下一步研究早期脑损伤的最合适的时间点。第二部分调控cypa/cd147对大鼠sah后早期脑损伤的干预作用及其可能的作用机制的实验研究目的探讨调控cypa/cd147信号通路对大鼠sah后早期脑损伤是否有干预作用及其可能的作用机制。方法1.实验动物分组:162只健康成年雄性sd大鼠随机分为9组,分别为假手术组,sah组,sah+人重组cypa(recombinanthumancyclophilina,rhcypa)组,sah+cypa小干扰rna(smallinterferingrnaofcypa,sicypa)组,sah+cypa小干扰rna对照组(controlgroupofsicypa,ctrsi)组,sah+cd147单克隆抗体(monoclonalantibodyofcd147,anti-cd147)组,sah+anti-cd147+rhcypa组,sah+anti-cd147+sicypa组,及sah+anti-cd147+ctrsi组,每组18只大鼠。2.sah模型制作:应用视交叉前池注血法制成sah动物模型。3.给药方法:在sah+rhcypa组中,sah模型建成后15分钟内在视交叉前池注入1μg/20μl人重组cypa;在sah+sicypa组及sah+ctrsi组中,大鼠造模前24小时,500pmol/20μlcypasirna或者controlsirna在立体定向仪引导下通过微量注射器注入脑室;在sah+anti-cd147组中,在sah造模后立即将cd147的单克隆抗体以3mg/kg的剂量静脉注射。sah+anti-cd147+rhcypa组,sah+anti-cd147+sicypa组及sah+anti-cd147+ctrsi组中的给药方法同上。4.检测指标:sah动物模型建立完毕的24小时后检测各组动物的神经功能评分,并且留取血标本检测cypa的浓度,然后处死大鼠,取出大鼠颞底皮层脑组织做标本。采用蛋白质印迹(western-blot)法分析脑组织中cypa、cd147、细胞外调节蛋白酶(extracellularsignal-regulatedproteinkinase,erk)1/2、p-erk1/2、p53、caspase-3和免疫球蛋白g(immunoglobuling,igg)的表达情况;采用免疫荧光染色来分析cypa、cd147、p-erk1/2、p53、caspase-3在神经元中的表达;采用干湿法测定水肿指数;采用tunel荧光染色检测脑组织神经元细胞及脑微血管内皮细胞的凋亡情况;采用fluoro-jadeb荧光染色测定脑皮层细胞坏死情况;采用免疫沉淀法测定cypa和cd147的相互作用;采用emsa法检测核因子κb(nuclearfactor-κb,nf-κb)的活性。结果1.大鼠sah后24小时,与假手术组相比:cypa及cd147在脑组织中的表达明显增高(p<0.01);血清中cypa的表达增高(p<0.05);神经行为学损害加重(p<0.01),脑水肿及脑组织白蛋白含量显著增加(p<0.01);tunel及fjb阳性细胞明显增多(p<0.01);脑组织及神经元中磷酸化的erk1/2表达水平明显增高(p<0.01),nf-κb的结合活性明显增高(p<0.01),p53和caspase-3表达水平增加(p<0.01)。2.用cd147单克隆抗体或cypa小干扰rna干预后,与sah对照组相比,cypa或cd147在脑组织中的表达明显下降(p<0.05);cypasirna可以降低血清中cypa的表达(p<0.05);大鼠的神经行为学损害有所减轻(p<0.01);脑水肿及脑组织白蛋白含量有所减轻(p<0.05);tunel及fjb阳性细胞明显减少(p<0.01);脑组织及神经元中磷酸化的erk1/2表达水平显著下降(p<0.05),nf-κb的结合活性明显降低(p<0.05),p53和caspase-3表达水平有所下降(p<0.05)。3.用人重组cypa干预后,与cypasirna及anti-cd147干预产生相反的结果,即与对照组相比,cypa及cd147在脑组织中的表达增加(p<0.05);血清中cypa的表达增加(p<0.05);大鼠的神经行为学损害明显加重(p<0.01);脑水肿加重(p<0.05)及脑组织白蛋白含量增加(p<0.01);tunel及fjb阳性细胞明显增多(p<0.05);脑组织及神经元中磷酸化的erk1/2表达水平明显增加(p<0.01),nf-κb的结合活性明显增加(p<0.05),p53和caspase-3表达水平明显增加(p<0.01)。4.用cypasirna及anti-cd147共同干预后,较单独应用cd147干预相比,可以更明显增强抗细胞死亡效果(p<0.01)、减轻脑水肿(p<0.01)、降低磷酸化的erk1/2表达(p<0.05)、降低p53和caspase-3表达(p<0.05)。5.免疫荧光染色结果也显示,与sah对照组相比,用cypasirna干预可以降低脑组织神经元中cd147的表达(p<0.05);但用cd147单克隆抗体干预,对脑组织神经元中cypa的表达则无明显影响(p>0.05),提示cypa可能是cd147的上游信号因子。6.免疫沉淀反应检测结果显示sah后24小时,cypa和cd147的相互作用增加。结论1.细胞外CyPA与细胞膜CD147结合,通过激活ERK1/2-nuclear factor-κB信号通路,再促进细胞凋亡,参与SAH后早期脑损伤的病理过程。2.CyPAsiRNA和CD147单克隆抗体治疗对SAH后早期脑损伤有保护作用。3.人重组CyPA加重SAH后早期脑损伤。4.CyPA通过与其受体CD147相结合参与SAH后早期脑损伤的病理过程,其可能是CD147的上游信号调控因子。5.CyPA/CD147可能是治疗SAH的一个新的靶点。