目的 初步研究和建立微型寡核苷酸芯片快速检测脑脊液标本中常见病原菌的方法,为最终完善并建立脑脊液病原微生物感染寡核苷酸检测芯片的技术路线和实验方案进行初步探索。 方法① 通过对脑脊液标本中常见病原菌16S rRNA基因保守区的序列分析,设计通用引物(Universal primer, UP),对不同细菌的DNA进行UP-PCR扩增,确定标本是否有细菌感染。②用Primer Premier软件分别设计所有细菌的通用探针、革兰阳性和阴性菌通用探针、肠杆菌科的属探针、嗜血杆菌属探针、脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌探针、凝固酶阴性葡萄球菌探针、肺炎链球菌探针,及产单核李斯特菌探针,将探针加尾后固定于尼龙膜上,制成简易寡核苷酸芯片。③提取各病原体DNA后UP-PCR扩增,扩增过程中用Bio-16-dUTP进行标记;将上述扩增产物变性后分别与点有各种探针的尼龙膜反向杂交,然后用碱磷酶标记链霉亲合素进行显色。④对检测体系的敏感性和特异性进行了测试;⑤利用该寡核苷酸芯片检测方法对32例经临床实验室常规培养鉴定方法确定为细菌感染的CSF标本进行鉴定。 结果 ①所有实验菌株经UP-PCR扩增均获得372bp左右的产物,与设计相符。②该方法最低可检测出10CFU/mL的大肠埃希菌;③每种探针只与通用探针及其相应的细菌DNA杂交,而不与其他细菌探针及阴性对照探针杂交,表明所有探针均具有较高的特异性;④该方法和常规培养鉴定方法对32例临床CSF标本的检测结果完全一致。 结论 本研究初步建立的CSF病原菌寡核苷酸芯片检测芯片能够准确、敏感、快速、高效地检测脑脊液标本中病原菌的感染;本研究结果为进一步完善和建立脑脊液病原微生物感染寡核苷酸检测芯片打下了基础,并值得临床推广应用。