目的:肌萎缩侧索硬化症为神经系统变性疾病的一种,其特征是选择性的侵犯脊髓前角细胞、脑干运动神经元、皮质锥体细胞及锥体束,导致上、下运动神经元变性死亡。患者出现上下运动神经元同时损害的临床特征,以单侧或双侧手指活动笨拙无力为常见首发症状。本病晚期出现延髓麻痹,在患者意识始终清醒的情况下,出现舌肌萎缩、构音不清、饮水呛咳、吞咽困难等症状,严重影响患者生存质量,给患者带来巨大痛苦。随着疾病病程的持续进展,在发病之后3~7年内多因呼吸肌受累死于肺部感染或呼吸肌麻痹所致的呼吸衰竭。目前国际范围内对ALS发病机制的相关研究主要关注于其相关突变蛋白h SOD1-G93A,因此,针对此突变蛋白所造成的损伤进行治疗方面的研究就具有重要意义。番茄红素是一种含有碳碳共轭双键的类胡萝卜素,因其结构中大量的C=C-C=C存在使得其具有抗氧化能力。现有研究证实,番茄红素能够通过Nrf2-ARE信号转导通路,上调Ⅱ相解毒酶的表达,从而保护细胞,对抗氧化损伤。目前研究发现,在SOD1突变模型中,至少有14种受Nrf2调控的基因表达出现下调,包括NQO1、GST、HO-1、细胞色素P450、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等。但是目前国内外均缺乏将番茄红素应用于治疗神经系统变性疾病的体外实验证据。本实验采用突变的h SOD1-G93A质粒转染NSC34细胞,从抗氧化应激角度探讨番茄红素对转染h SOD1-G93A的NSC34细胞的影响及其可能机制,为将来寻求治疗肌萎缩侧索硬化症广泛普及的药物打下初步的研究基础。方法:1实验分组实验设置空白对照组、转染空质粒组、转染h SOD1-G93A组以及不同浓度的番茄红素处理组(1.5μmol/L,2.5μmol/L,7.5μmol/L)。以DMSO溶解番茄红素,于转染操作后24小时向各组细胞加入DMSO或不同剂量的番茄红素(1.5μmol/L,2.5μmol/L,7.5μmol/L)继续培养24小时,用于后续实验。2细胞培养及质粒转染取冻存于液氮罐中的NSC34细胞,予以复苏。培养液使用含有10%灭活的胎牛血清及青链霉素的高糖DMEM,培养条件为37℃、5%CO2。于细胞复苏传代3次以后,待细胞突起明显、形态良好、汇合度为80%~90%时,于细胞对数生长期分别转染h SOD1-G93A质粒、空质粒。转染操作过程依照LipofectamineTM 2000试剂说明书进行规范操作。转染操作后24小时给予番茄红素处理,继续培养24小时。即转染后48小时收集标本,用于后续实验。3细胞丙二醛(MDA)含量检测收集转染后48小时的各组细胞,使用硫代巴比妥酸(TBA)法测定细胞MDA水平。操作过程依照试剂说明书进行规范操作,于532nm处,读取吸光度值。4目的蛋白表达水平检测——蛋白免疫印迹(Western Blot)提取细胞总蛋白,以Bicinchoninic acid(BCA)法测定细胞总蛋白浓度。以60μg为蛋白上样量,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。之后,将凝胶中的蛋白电泳转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将PVDF膜与一抗于4℃摇床孵育至少12小时。再将PVDF膜与结合有荧光染料的二抗于室温下避光孵育1小时。之后使用Odyssey双色红外荧光成像系统对PVDF膜进行扫描,结合Image J软件进一步确定目的蛋白表达水平。5细胞凋亡率测定消化各组NSC34细胞,制备成单细胞悬液,500rpm,5分钟条件下离心,弃上清,将细胞以预冷的PBS重悬并计数。取1-5*105个细胞再次以上述条件离心,弃上清,加入500μl 1x Binding buffer重悬,再加入5μl PI,室温避光孵育30分钟,利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:1成功培养NSC34细胞,完成质粒转染于倒置荧光显微镜下观察证实,NSC34细胞贴壁良好,形态规则,突起明显,成功培养NSC34细胞。于倒置荧光显微镜下观察转染空质粒组、转染h SOD1-G93A组和番茄红素处理组的细胞,证实均存在EGFP绿色荧光;对于转染h SOD1-G93A组和番茄红素处理组细胞,蛋白质免疫印迹法在相应位置检测到含EGFP标签的外源性SOD1(Fig.5),流式细胞仪测定转染效率为23.30%和26.21%,质粒转染完成。2丙二醛(MDA)含量测定MDA含量代表了细胞脂质过氧化水平,可间接反映氧化应激水平。收集转染48小时后细胞,测定MDA,结果显示,空白对照组与转染空质粒组细胞MDA含量差异无统计学意义(P<0.05),转染h SOD1-G93A组细胞MDA含量明显高于转染空质粒组(P<0.05),达2.25nmol/mgprot。各个番茄红素处理组(1.5μmol/L、2.5μmol/L、7.5μmol/L)的MDA含量均不同程度的高于转染h SOD1-G93A组,分别为1.94 nmol/mgprot、1.46 nmol/mgprot、1.30 nmol/mgprot,呈剂量相关性,有统计学意义(P<0.05)。证实转染h SOD1-G93A能够引起NSC34细胞脂质过氧化损伤,番茄红素能够减轻这种损伤,减轻程度与给药浓度呈剂量相关性。3 NQO-1表达水平测定NQO-1是涉及对抗活性氧损伤的一种关键酶,在氧化应激条件下NQO-1的表达被诱导,为细胞提供多重保护。NSC34细胞转染h SOD1-G93A后24小时给予番茄红素(7.5μmol/L)、48小时收集细胞并提取细胞蛋白用于蛋白质免疫印迹,观测NQO-1蛋白表达水平的变化。结果显示,相比于空白对照组,转染h SOD1-G93A组NQO-1蛋白表达水平明显下降,为29.85%,番茄红素处理组(7.5μmol/L)NQO-1蛋白表达水平为67.01%,明显高于转染h SOD1-G93A组,有统计学意义(P<0.05)。4细胞凋亡率凋亡中、晚期细胞以及死亡细胞,细胞膜的完整性受到比较严重的破坏,碘化丙啶(PI)可进入细胞内将细胞核红染,可用来较为客观地判定细胞凋亡率。转染h SOD1-G93A 24小时后给予番茄红素处理(1.5μmol/L、2.5μmol/L、7.5μmol/L),48小时后收集细胞用于凋亡率检测。结果显示相比于转染h SOD1-G93A组40.08%的凋亡率,各番茄红素处理组(1.5μmol/L、2.5μmol/L、7.5μmol/L)细胞凋亡率均降低,分别为36.55%、30.15%、24.8%,且降低程度与番茄红素给药浓度呈剂量相关性,有统计学意义(P<0.05)。结论:番茄红素对转染h SOD1-G93A的NSC34细胞有保护作用,主要表现为:1减轻细胞脂质过氧化,且减轻程度与番茄红素浓度呈剂量相关性。2上调了NQO-1蛋白表达水平。3降低细胞凋亡率。