酶法水解牡蛎活性多肽的研究

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牡蛎被我国卫生部列入药食两用名单,具有很好的营养与保健作用。我国牡蛎资源极为丰富,但产品加工形式单一,主要为干制品。本论文以牡蛎为原料,通过蛋白酶水解制备牡蛎蛋白肽,经葡聚糖凝胶柱层析纯化分离抗氧化活性肽组分,利用高效液相结合飞行时间串联质谱技术分析抗氧化肽的氨基酸序列,并通过体外清除自由基活性和细胞实验对其抗氧化活性进行评价,为牡蛎资源的高值化开发提供依据。主要研究结果如下:以酶解产物对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的清除率、水解度和酶解产物分子量分布为指标,比较分析了6种蛋白酶对牡蛎蛋白的水解效果和水解产物的抗氧化活性,选定中性蛋白酶为牡蛎蛋白水解用酶。在单因素实验基础上,利用响应面设计实验对中性蛋白酶水解牡蛎蛋白的条件进行优化,最终确定适宜的水解条件为:酶解温度48℃,料液pH7.6,底物浓度1.04%,用酶量2000 U/g,酶解时间12 h。酶解所得牡蛎蛋白肽经Sephadex G-25凝胶柱分离纯化,得到NA、NB、NC和ND四个主要组分,组分NA、NB清除DPPH自由基活性明显高于组分NC、ND。利用HPLC、MALDI TOF-MS/MS对NA、NB、NC、ND四组分进行氨基酸序列分析,得到7种目的多肽,它们的氨基酸序列分别为:LDLYLS(812 Da)、VLSGGTT(741 Da)、REYKQ(723.8Da)、LLRALTK(814.8 Da)、RRKRAAG(814.8 Da)、AAELQ(531.6 Da)、SAFW(509.9 Da)。体外清除自由基活性检测表明,牡蛎蛋白肽及其组分NA、NB都表现出较好的清除DPPH自由基活性,其中NA活性最强,清除率达到67.1±0.61%;牡蛎蛋白肽同时表现出较强的清除羟自由基和超氧阴离子自由基活性,组分NA清除羟自由基活性最强,清除率达到48.5±0.57%,但清除超氧阴离子自由基活性最小,组分NB有较强的清除超氧阴离子自由基活性,但清除羟自由基活性极低。通过分析牡蛎蛋白肽及其组分NA、NB对LO2细胞存活率、LDH漏出率、MDA水平、H2O2损伤LO2细胞内GSH-Px、SOD活力的影响,得出牡蛎蛋白肽及其组分NA、NB对由H2O2诱导的LO2细胞的氧化损伤具有保护作用。
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