油桐花芽分化调控途径及其相关基因研究

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油桐(Vernicia fordii)是我国特有的亚热带地区代表性经济树种,也是重要的工业油料和新兴生物能源树种,其独特的生物学特性使其成为适于木本油料植物发育生物学研究的实验材料。本文以具有独特早花性状的对年桐为研究材料,对油桐花芽分化过程中相关基因进行研究,不仅可为油桐花期调控和开花分子机理的研究奠定理论基础,还将为油桐的分子育种提供潜在的基因资源。本研究首先利用Illumina测序技术对处于不同花芽分化期(8月和10月)的花芽转录组进行了测序,并对转录组数据进行生物信息学分析,从中发掘出大量与花芽分化相关的基因信息。随后通过代谢途径分析对花芽的蔗糖、淀粉代谢和氮素代谢途径进行了解析,对油桐花芽分化过程中营养物质积累与利用、运输与分配有了初步了解。最后以上述研究结果为基础,对FLC、LFY和SOC1基因进行了基因克隆和表达模式分析。主要研究结果如下:1、油桐花芽分化末期转录组数据的序列组装、基因功能注释和分类。对5.8Graw reads原始数据进行去冗余分析后,获得5.4G clean reads。对clean reads进行组装拼接后获得106,507条contig序列和59,270条unigene序列。Contig序列长度主要分布在200bp-3,000bp之间,其中200bp-1,200bp的contig序列数量最多,占总contig序列数量的93.54%,而unigene序列长度主要分布在300bp-3,000bp范围内,其中300bp-1,600bp的unigene序列数量最多,占总unigene序列数量的88.64%。共有44,579条unigene序列获得了基因功能注释,其中NR注释42,655条,Swiss-Prot注释25,052条,KEGG注释23,070条,COG注释14,413条。COG数据库注释的unigene序列可划分为25类,GO功能注释的unigene序列可分为生物过程、细胞组分和分子功能3大类和62个亚类。通过KEGG数据库的代谢途径富集性分析,所有非冗余unigene序列可归类于128个代谢通路。将所有非冗余unigene序列与拟南芥开花相关基因进行同源性比对后,从中发掘出96个与油桐开花相关的基因。2、油桐2个不同花芽分化期(8月、10月)的基因差异表达分析。对油桐2个不同花芽分化期的转录组数据进行比较分析,从中筛选出24,566个差异表达基因,其中上调基因14,182个,下调基因10,384个。通过GO分析和KEGG代谢途径分析,分别将差异表达unigene归类于55个GO类别和128个代谢途径。通过基因差异表达分析,筛选出一系列油桐花芽分化相关基因,在自主调控途径、赤霉素调控途径、春化调控途径及光周期途径中,大部分基因上调表达。通过蔗糖与淀粉代谢途径、氮素代谢途径等基础代谢途径中关键酶基因的表达模式分析,同时结合花芽生理生化指标的变化,对油桐花芽分化过程中营养积累与利用、运输与分配的情况进行了阐述。3、油桐FLC、LFY和SOC1基因的克隆与功能研究。利用RACE技术克隆了油桐FLC、LFY和SOC1的全长cDNA序列,其长度分别为916bp、1,370bp和1,036bp。通过多序列比对发现,油桐FLC、LFY和SOC1的蛋白质序列与其它植物的FLC、LFY、SOC1序列之间具有很高的同源性,这表明我们克隆出的基因确实是油桐的FLC、LFY和SOC1基因。系统演化分析发现,油桐LFY和SOC1基因与麻风树的LFY和SOC1基因的亲缘关系最近,而油桐FLC基因与白桦的FLC基因亲缘关系最近。油桐LFY、FLC和SOC1基因在花芽发育的不同时期及叶芽中均有表达,且其表达模式具有明显差异。LFY基因在花芽发育过程中先下调再上调表达,FLC基因则是先上调再下调表达,其表达量从分化前期到分化中期迅速增加,之后基因表达量下调。SOC1基因的表达量变化趋势与LFY基因的表达变化趋势一致。FLC基因在油桐叶芽中的表达量高于花芽,而LFY和SOC1基因的表达模式与之相反。研究结果表明,油桐成花除了受自主途径、赤霉素途径、春化途径和光周期途径调控之外,还受淀粉、糖、含氮化合物的影响。本研究通过对成花途径整合基因LFY、FLC和SOC1的克隆及其在花芽分化过程中的表达模式分析,初步阐述了油桐花芽分化的分子机制,为油桐的花期调控机理研究提供了理论基础。
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