[背景]肝纤维化是多种慢性肝病,如:酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝的共同病理过程,对肝纤维化进行准确的诊断与治疗一直是困扰医学界的重大难题。新近研究表明,肝纤维化过程中伴随有病理性血管生成及肝窦毛细血管化现象,这对于肝纤维化的诊断、治疗以及预后具有重要意义。因此,调控肝纤维化过程中肝窦毛细血管化及肝血窦内环境有望成为防治肝纤维化的潜在策略。本课题组近年来对天然产物川考嗪(tetramethylpyrazine,TMP)的抗肝纤维化作用与分子机理进行了较为深入的研究,发现其可以抑制肝星状细胞(HSC)的增殖、活化,促进HSC凋亡。鉴于以上发现,我们提出TMP可能通过改善病理性血管生成发挥抗肝纤维化作用的假说。本论文对此进行了深入的研究。[方法]本论文首先从体内角度研究了 TMP对肝纤维化过程中血管生成的改善作用。通过腹腔注射四氯化碳(CCl4,40%)的方法建立大鼠肝纤维化模型,预防给予TMP(100mg/kg)处理。组织学检测各组大鼠肝脏病理变化;扫描电镜(SEM)观察肝窦内皮细胞(LSEC)窗孔结构;ELISA检测不同组别大鼠肝组织匀浆及血清中血管内皮生长因子A(VEGF-A)、血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)的表达水平;Real time-PCR、Western blotting及免疫荧光检测肝组织中VEGF-R2、PDGF-βR、Smo和Gli1等的mRNA和蛋白表达水平。其次,我们应用VEGF-A构建原代小鼠LSEC促血管生成模型;采用Matrigel小管形成实验检测TMP对VEGF-A诱导的LSEC促血管生成能力的影响;ELISA检测TMP对VEGF-A诱导的LSEC细胞上清中PDGF-BB及Shh表达水平的影响;Real time-PCR、Western blotting及免疫荧光检测TMP对促血管生成分子:VEGF-R2、PDGF-βR与HIF-1α等及Hedgehog信号通路相关分子Patched1(Ptcl)、Smoothened(Smo)和Gli1等表达的影响。最后,我们通过小鼠尾静脉注射Smo过表达质粒,进一步明确TMP抗肝纤维化药理效应。[结果]体内实验结果表明,TMP能够显著缓解CCl4诱导的大鼠肝脏组织损伤、抑制胶原纤维的产生与沉积,进而改善肝纤维化。TMP通过维持和上调LSEC窗孔的数量、下调LSEC毛细血管化水平及促血管生成相关信号分子的表达,显示对肝纤维化过程中病理性血管生成的阻断作用。体外实验表明,TMP能够剂量依赖性抑制LSEC的促血管生成行为。Matrigel小管形成实验也发现,TMP能够明显减少LSEC形成的小管数目及长度。因此,本研究表明,TMP能够通过抑制病理性血管生成从而改善化学诱导的肝纤维化,并且TMP的这一作用可能是通过调控LSEC表型实现的。本文接下来将对LSEC促血管生成行为的分子机理进行深入研究。现已明确,LSEC作为肝脏特有的血管内皮细胞,受多种促血管生成细胞因子的调控,其中血小板内皮细胞生长因子(PDGF)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)等在分化型LSEC转化为毛细血管化型LSEC,进而发挥促血管生成作用方面扮演重要角色。因此,本论文探讨TMP对LSEC促血管生成行为的分子机理进行了深入研究。实验结果表明,TMP通过阻断Hedgehog信号通路活性抑制毛细血管化型LSEC的促血管生成作用。TMP主要通过减少肝纤维化过程中Hedgehog信号通路配体Shh的含量,抑制Hedgehog信号通路关键膜受体蛋白Ptcl与Smo的表达,并抑制Gli1的激活、入核,阻断Glil与促血管生成靶基因的顺式作用原件结合,进而下调促血管生成相关靶基因的表达。此外,我们进一步使用Hedgehog信号通路特异性抑制剂环杷明(Cyc)、激动剂SAG考察TMP调控Hedgehog信号通路与抑制LSEC促血管生成的相关性。结果发现,Cyc可发挥与TMP相似的抑制LSEC促血管生成作用,而SAG则可以逆转TMP的这一作用。实验研究表明,TMP可以通过抑制Hedgehog信号通路的活性阻断LSEC促血管生成行为。[结论]本论文通过实验研究发现LSEC促进病理性血管生成行为的分子机理与分子靶标,有助于揭示LSEC表型改变(即由分化型转变为毛细血管化型)在肝纤维化病理性血管生成中所发挥的重要作用。在此基础上明确了 TMP抑制肝纤维化过程中肝窦血管生成的分子机制,为靶向Hedgehog通路的抗肝纤维化新药研发提供理论与实验依据。