论文部分内容阅读
金针菇免疫调节蛋白是一种从金针菇子实体中提取的具有免疫调节活性的小分子蛋白,在促进淋巴细胞增殖,激化T-淋巴细胞产生大量细胞因子,抗过敏和抑制癌细胞增长等方面都有很明显的作用。本论文从金针菇基因组中克隆出编码金针菇免疫调节蛋白的基因,构建表达载体pPIC9K-FIP-fve和pET-28(+)-FIP-fve,分别通过电转化法和热转化法转入酵母菌株GS115和大肠杆菌菌株BL21中。经过培养筛选稳定表达的重组子,有效的表达了重组金针菇免疫调节蛋白,在酵母中的表达量为152mg/L,在细菌中的表达量为30mg/L。表达粗产物经过透析,DEAE Sepharose Fast Flow离子柱层析和低温冻干后获得纯化的重组蛋白,纯度为80%左右。对酵母菌发酵所获得的重组蛋白的生物学特征进行检测,其氨基酸组分分析表明重组表达的金针菇免疫调节蛋白具有和天然蛋白相同的氨基酸组分。圆二色谱分析其二级结构单元具有和天然蛋白类似的相对比例,说明酵母表达的重组金针菇免疫调节蛋白能形成二级结构并且能够正确折叠和具有生物学活性。糖含量分析表明重组金针菇免疫调节蛋白含有4.2%的糖,表明重组免疫调节蛋白在酵母表达系统中可能发生了糖基化修饰。对纯化后的重组金针菇免疫调节蛋白进行生物学活性测定,结果表明重组蛋白表现与天然金针菇免疫调节蛋白一致的血细胞凝集活性,而且可以通过促进人外周血单个核细胞周期G1/G0期向S期转化而具有促进淋巴细胞增殖活性,表明此蛋白可以作为一种细胞有丝分裂原。本论文克隆了金针菇免疫调节蛋白基因并且获得了该蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母中的高效重组表达,同时证实了在酵母中重组表达的免疫调节蛋白具有和天然蛋白相类似的生物学活性。本实验结果为深入研究金针菇免疫调节蛋白的功能和作用机制以及大规模获得重组真菌免疫调节蛋白,进一步开发其在抗肿瘤、抗过敏、保健品和药品等方面的应用提供了实验依据和技术基础。