论文部分内容阅读
肝性脑病(hepatic encephalopathy, HE)是由肝功能严重不足引起的神经功能紊乱综合征,是肝病患者最常见的并发症和死亡原因之一。关于其发病机制的学说众多,至今尚未完全阐明,临床上也无特效疗法。HE的运动障碍和中枢神经系统(central nervous system, CNS)内的基底神经节的精细调控状态密切相关。在基底神经节复杂的网络中,黑质网状部(substantia nigra pars reticulate, SNr)是运动调控环路上的关键一环,主要由γ-氨基丁酸(Gamma-amino butyric acid, GABA)能投射神经元组成。研究表明,GABA与HE的脑细胞功能紊乱密切相关,但其作用机制尚不明确。氯离子(Cl~-)是细胞内最重要的阴离子。特别在神经系统,神经元内外氯离子浓度保持相对平衡状态,即形成氯离子稳态,是维持神经元和局部环路形态和机能稳定的内环境基础。氯离子稳态失衡可引起GABA能传递的改变,氯离子稳态及其调控因子已经成为多种GABA相关神经病理性疾病的潜在治疗靶点。研究显示CNS内不同部位的氯稳态失衡参与多种神经功能紊乱,然而其在HE中的作用尚不清楚。Na~+-K~+-2Cl~-共转运体1(Na~+-K~+-Cl~-cotransporter1, NKCC1)和K~+-Cl~-共转运体2(K~+-Cl~-cotransporter2, KCC2)是一组结构相似、功能截然相反的氯离子转运体。NKCC1为氯离子内向转运体,KCC2为氯离子外向转运体,两者共同介导神经元氯离子稳态以实现对GABA效应的调控。研究表明,NKCC1和KCC2在多种GABA相关神经病理性疾病中发生表达或者功能的改变,进而实现对GABA能神经传递的影响作用。然而,这两个转运体在HE发病机制中是否发挥作用尚不明确。本研究深入探讨HE状态下SNr内的氯离子稳态失衡情况及可能的分子机制,以期从新的角度阐明HE的中枢发病机制、为寻找有效的HE临床治疗手段提供实验室依据。本研究使用谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)67-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)转基因小鼠。在该基因敲入小鼠体内,GFP的表达受GAD67启动子序列的调控,因此所有的GABA能神经元均被GFP绿色荧光蛋白所标记,该特点能够很好的解决传统染色方法无法清晰、准确的标记GABA能神经元这一关键问题。目的:1、以GAD67-GFP转基因小鼠为研究对象,探讨SNr内GABA能神经元氯稳态失衡在急性HE运动缺陷中的作用及可能的作用机制。2、检测临床上不同类型患者的NKCC1、KCC2的表达水平,同时分析其与患者肝脏功能、神经功能之间的关系。方法:1、使用硫代乙酰胺(thioacetamide, TAA)腹腔注射建立HE模型,通过血清转氨酶检测、血氨及大脑氨含量的测定、大脑含水量测定、肝脏组织学染色、神经系统功能评分、旷场实验等来验证实验小鼠出现HE及运动迟缓;利用荧光染料孵育脑薄片结合激光共聚焦显微镜观察,检测HE小鼠SNr内GABA能神经元内的氯离子浓度的变化情况;利用实时定量反转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)和Western blot分别在mRNA和蛋白水平检测NKCC1和KCC2的表达变化情况;进行双重免疫染色法,即使用抗GFP抗体检测SNr内GABA能神经元和使用抗酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)抗体检测黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNc)多巴胺神经元,检测KCC2在神经元中亚细胞分布情况;进行神经元尼氏染色评估TAA处理是否会改变SNr内GABA能神经元的数量;通过立体定位手术黑质内注射NKCC1选择性抑制剂布美他尼或KCC2阻断剂己二酸二异辛酯(di-isooctyladinpate, DIOA),评估其对血清转氨酶水平、血氨水平、大脑氨含量、大脑含水量、肝脏组织学染色、运动能力等的影响。2、利用实时定量RT-PCR检测36名患有Ⅲ-Ⅳ期HE的肝硬化患者、20名未患HE的肝硬化患者及15名健康对照组的NKCC1和KCC2的mRNA水平,使用2CT方法计算表达情况。同时分析KCC2的水平与Child-Pugh评分、MELD评分、Glasgow昏迷评分及血氨水平的相关性。结果:1、TAA处理导致HE和运动迟缓。氯离子成像结果显示HE小鼠SNr内GABA能神经元内的氯离子浓度升高。HE小鼠KCC2在mRNA及蛋白水平的表达都下降,在神经元细胞膜处的表达下降尤为明显;与此相反,NKCC1的表达没有明显变化。TAA处理并不能改变SNr内GABA能神经元的数目。黑质内注射DIOA使正常小鼠的血清转氨酶水平升高,而黑质内注射布美他尼,虽然能改善HE小鼠的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平,但并不能降低天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)水平。黑质内注射DIOA的正常小鼠肝脏组织学染色结果基本正常,黑质内注射布美他尼并不能改善HE小鼠的肝脏坏死和炎性病变。黑质内注射DIOA和布美他尼的HE小鼠在血氨水平、大脑氨含量和大脑含水量等方面,没有明显变化。黑质内注射DIOA可导致运动能力的下降,在HE小鼠可导致运动迟缓进一步加剧;相反,在HE小鼠黑质内注射布美他尼并不能使其运动能力恢复正常。2、患有HE的肝硬化患者KCC2mRNA的水平与未患HE的肝硬化患者及健康对照组相比明显下降;然而,NKCC1mRNA水平在各组之间无明显差异性。此外,患有HE的肝硬化患者的KCC2mRNA水平与Child-Pugh评分、MELD评分及血氨的水平呈负相关,与Glasgow昏迷评分呈正相关。结论:1、氯稳态失衡可能是HE导致的运动迟缓的病理生理学基础,恢复氯稳态的相关药物可能成为治疗肝功能衰竭的潜在性选择。2、KCC2和NKCC1的表达失衡可能成为预测HE的信号。