甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤,其发病率在世界范围内呈稳步上升趋势。目前对于甲状腺癌的诊断方法主要依赖超声影像指导下的细针穿刺活检（Fine-needle aspiration biopsy,FNAB）,但是FNAB作为一种侵入性检查不仅对执行操作的医生有较高的技术要求,还存在创伤较大、易出现穿刺路径转移和有出血风险等缺点。另外有约20%-30%的甲状腺结节存在因缺乏典型的显微镜下病理特征或处于后间隙位置不便穿刺检查等限制,难以通过FNAB确定其良恶性。分子生物学变异是甲状腺癌发生发展过程中的重要的肿瘤标志,对基因水平的变异进行检测能够有效地对甲状腺癌进行早期筛查、辅助诊断、疾病监测和指导预后。因此,有必要开发和利用高效便捷的分子诊断方法,对甲状腺癌相关的分子标记物进行高灵敏度和特异性地检测,为临床上早期筛查、辅助诊断和分型以及指导治疗提供帮助。存在于肿瘤组织的基因组DNA和循环血液的循环肿瘤DNA（Circulating tumorDNA,ctDNA）中致癌突变的定性和定量分析在癌症的早期筛查和精确诊断中发挥着越来越重要的作用。ctDNA是来源于肿瘤组织的细胞外游离DNA（Cell-freeDNA,cfDNA）,携带了与原发肿瘤细胞相同的分子生物学特征,包括单核苷酸突变（Single nucleotide polymorphism,SNP）、插入或缺失变异（Insertion＆deletion,In Del）、拷贝数变异（Copy number variant,CNV）和甲基化改变等。ctDNA的检测揭示了肿瘤的全面遗传信息,可以准确指示肿瘤组织的异质性。同时,因为ctDNA在体内的半衰期很短（＜2 h）,所以实时监测ctDNA可以反映肿瘤的动态进展。但是ctDNA在血液中含量较少,DNA序列长度较短并且在血液中存在多种杂质影响其提取和检测,导致它对富集和分析的效率都有着较高的要求,这限制了ctDNA在甲状腺癌诊疗过程中的临床应用。因此,如何在有限血液样品中获得足量的cfDNA应用于ctDNA的检测是我们所面临的技术难题。而发展高灵敏度和特异性的分子诊断技术,对微量核酸样本进行准确可靠的分析是解决这一问题的关键。三维导电水凝胶作为一种新型的导电材料,具有十分优越的物理化学性质,如:较大的比表面积、良好的生物相容性和具有电子传递能力等。这些优越的性质使导电水凝胶在生化分析领域具有广泛的应用,特别是在电化学生物传感器中发挥其独特的优势。微阵列基因芯片具有高通量、灵敏度高、样品需求量少和自动化程度高等优点,适合微量生物样本的高效检测。而突变扩增系统-实时荧光定量聚合酶链式反应（Amplification refractory mutation system-quantitative polymerase chain reaction,ARMS-q PCR）法具有操作简单、耗时较短、重复性好和灵敏度高的优点,具有标准的结果判定体系并且有成熟的技术转化方案。鉴于目前甲状腺癌分子诊断技术领域存在的困境和局限性,本研究首先将聚合物导电水凝胶应用于循环血液中cfDNA的高效富集;其次,开发了基于荧光微阵列基因芯片和ARMS-q PCR的甲状腺癌相关SNP的高灵敏分析方法;最后,结合开发的电化学富集法和ARMS-q PCR法建立了基于电化学富集法的ARMS-q PCR（Electrochemical-enrichment assisted ARMS-q PCR,EC-ARMS-q PCR）策略用来高效富集并检测甲状腺癌相关ctDNA。本研究为基于ctDNA分析的甲状腺癌早期筛查和疾病监测提供了新思路,突破了cfDNA提取和富集的技术瓶颈,为解决高灵敏分析ctDNA中的疾病相关SNP的关键问题提供了新方法。本文主要包含以下四个部分:工作一、聚丙烯酰胺/植酸/聚多巴胺导电水凝胶用于循环肿瘤DNA的电化学富集本工作开发了一种聚丙烯酰胺/植酸/聚多巴胺导电水凝胶修饰的玻碳电极,即GCE-PAAM/PA/PDA,通过水凝胶表面电荷的电场介导作用富集血浆中的cfDNA。在最佳实验条件下,GCE-PAAM/PA/PDA对不同DNA显示出优异的富集效率和回收率,可从低至20μL的血浆中分离和富集ctDNA,具有高富集灵敏度（0.1 pmol/L）以及对78个核苷酸（Nucleotide,NT）的单链DNA（Single-strandDNA,ssDNA）有出色回收率（75%）。结合聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）扩增技术,通过在PTC、甲状腺结节（Thyroid nodule,TN）和来自临床实验室的随机患者的血浆样本cfDNA中筛选出具有BRAFV600E突变的ctDNA,证明了本方法的实用性。工作二、基于微阵列芯片的荧光分析方法应用于甲状腺乳头状癌相关BRAFV600E突变检测本工作建立了一种基于DNA芯片的荧光分析方法,通过优化DNA捕获探针的序列和杂交温度来选择性地检测BRAFV600E突变。在最佳实验条件下,该方法能够区分野生型BRAFV600和3种BRAFV600突变,且可检测等位基因突变频率低至0.1%的BRAFV600E。此外,使用本方法对15名临床患者甲状腺肿瘤组织样本中BRAFV600E突变水平进行检测,结果与商业化Sanger测序法进行比较,二者检测结果相当。结合不对称PCR扩增策略,本方法在检测不同临床样品中的BRAFV600E突变方面具有很大的潜力,为甲状腺癌的早期诊断、指导治疗和预后提供了一种新方法。工作三、突变扩增系统-实时荧光定量PCR（ARMS-q PCR）法用于甲状腺癌相关SNP的检测本工作基于等位基因特异性延伸反应原理,针对5种甲状腺癌相关的热点SNP(BRAFV600E、HRASG13R、PTENR130*、TP53R248Q和TP53D259Y)分别设计了等位基因特异性和非特异性引物对,结合Taq Man探针报告荧光信号,进行荧光实时定量PCR反应。通过等位基因特异性扩增反应和非特异性扩增反应的Ct值相减计算得出ΔCt值,并与截止ΔCt值作比较,对等位基因突变频率（Variant Allele Frequency,VAF）进行定量和定性评估。该方法成功用于检测甲状腺癌患者和结节性甲状腺肿患者的组织DNA,并根据结果评估临床敏感性和特异性。本方法具有较高的灵敏度、特异性和选择性,为复杂系统中微量等位基因特异性突变的分析提供了良好的技术支撑。工作四、基于电化学富集的ARMS-q PCR（EC-ARMS-q PCR）法检测甲状腺ctDNA中BRAFV600E突变本工作基于开发的电化学核酸富集法,结合ARMS-q PCR扩增策略,对富集到的样本同时进行等位基因特异性和等位基因非特异性扩增,通过计算得出ΔCt值,并与截止ΔCt值作比较,对VAF进行定量和定性评估,获得对肿瘤组织和血浆cfDNA中SNP的高灵敏度与特异性检测结果。利用EC-ARMS-q PCR分别在54名PTC患者和20名TN患者的血浆样本中检测到40.74%和10.00%的BRAFV600E突变ctDNA,且与FNAB匹配病理组织基因的BRAFV600E突变型之间的总体一致性为73.08%,表明EC-ARMS-q PCR检测具有较强的普适性,适用于液体活检样本的临床检测。