论文部分内容阅读
目的：1)探讨二甲双胍对HER2阳性胃癌细胞增殖、克隆形成、凋亡、细胞周期的影响；2)探讨二甲双胍抑制HER2阳性胃癌细胞增殖的作用机制；3)探讨二甲双胍与靶向药物曲妥珠单抗联合的协调作用。方法：1)Western blot、qRT-PCR检测常见胃癌细胞系中HER2蛋白表达水平；2)取对数生长期的HER2阳性胃癌细胞NCI-N87、OE19接种于细胞培养板中：加入不同浓度的二甲双胍(10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L、40 mmol/L、50 mmol/L)分别干预24h、48 h、72 h,用等量DMEM培养基处理作为对照组,CCK-8检测二甲双胍对HER2阳性胃癌细胞NCI-N87、OE19增殖的影响；结晶紫染色法检测二甲双胍对HER2阳性胃癌细胞NCI-N87、OE19的克隆形成能力的影响；流式细胞仪检测二甲双胍对HER2阳性胃癌细胞NCI-N87.OE19的凋亡、周期阻滞情况；Western blot检测二甲双胍对HER2阳性胃癌细胞NCI-N87、OE19的HER2蛋白表达水平及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响；3)CCK-8检测曲妥珠单抗联合二甲双胍对HER2阳性胃癌细胞NCI-N87、OE19增殖的影响。结果：(一)二甲双胍对HER2阳性胃癌细胞的影响：1)Western blot、qRT-PCR检测NCI-N87、OE19、AGS、MGC-803、BGC-823、MKN-45以及SGC-7901等七种常见的胃癌细胞株中HER2蛋白表达水平,HER2蛋白在NCI-N87、OE19细胞中呈高表达,在MGC-803、MKN-45细胞中呈弱表达,在AGS、BGC-823、SGC-7901细胞中不表达。2)CCK-8检测10、20、30、40、50 mmol/L的二甲双胍干预HER2阳性胃癌细胞NCI-N8724 h后细胞相对增殖率分别为1.391±0.070、1.289±0.044、1.199±0.017、0.978±0.052、0.952±0.041,干预48 h后细胞相对增殖率分别是1.779±0.069、1.593±0.236、1.385±0.158、1.142±0.082、0.789±0.055,干预72 h后细胞相对增殖率分别是2.511±0.118、1.882±0.090、1.528±0.067、0.898±0.041、0.499±0.019,与空白组对比,差异有统计学意义(p<0.05)；CCK-8检测相同浓度梯度的二甲双胍干预HER2阳性胃癌细胞OE1924 h后细胞相对增殖率分别为1.824±0.027、1.738±0.010、1.443±0.025、1.237±0.041、0.932±0.011,干预48 h后细胞相对增殖率分别是2.359±0.041、2.010±0.033、1.462±0.029、1.]03±0.018、0.723±0.021,干预72 h后细胞相对增殖率分别是3.704±0.083、3.033±0.037、1.658±0.027、0.860±0.032、0.316±0.009,24 h时间点中10、20 mmol/L二甲双胍处理组无统计学差异(P>0.05),其余同时间点各药物浓度组胃癌细胞的增殖下降率具有统计学差异(P<0.05)3)结晶紫染色法检测10、20、30、40、50 mmol/L的二甲双胍干预NCI-N87克隆形成能力,其中10、20、30 mmol/L组克隆形成率分别为72.500%±3.546%、25.000%±7.071%、6.500%±2.121%,与空白组相对比,差异有统计学意义(p<0.05),40、50mmo1/L组未见明显细胞克隆形成：结晶紫染色法检测相同浓度梯度的二甲双胍干预OE19克隆形成能力,其中10、20 mmol/L组克隆形成率分别为57.500%±10.607%、17.500%±3.536%,与空白组相对比,差异有统计学意义(p<0.05),30、40、50 mmol/L组未见明显细胞克隆形成。4)流式细胞仪检测10、20、30、40、50 mmol/L的二甲双胍干预NCI-N8748 h后细胞凋亡率分别为5.450%±0.574%、9.250%±1.630%、9.850%±0.759%、17.900%±4.028%、20.400%±1.512%,与空白组对比,差异有统计学意义(p<0.05)；流式细胞仪检测相同浓度梯度的二甲双胍干预OE1948 h后细胞凋亡率分别为3.800%±0.572%、7.450%±1.303%、8.350%±1.439%、17.475%±5.773%、22.825%±4.971%,其20、30、40、50 mmol/L组与空白组相对比,差异有统计学意义(p<0.05)。5)流式细胞仪检测]0、20、30、40、50 mmol/L的二甲双胍干预NCI-N8748 h后G1期细胞百分数依次为67.833%±0.702%、72.667%±1.060%、73.633%±0.850%、77.267%±0.306%、81.867%±0.416%,其20、30、40、50 mmol/L组与空白组相对比,差异有统计学意义(p<0.05)；流式细胞仪检测相同浓度梯度的二甲双胍干预OE19 48 h后G1期细胞百分数依次为66.800%±0.458%、68.800%±0.400%、70.067%±1.102%、76.567%±0.709%、79.600%±0.900%,其20、30、40、50 mmol/L组与空白组相对比,差异有统计学意义(p<0.05)。(二)二甲双胍抑制HER2阳性胃癌细胞增殖的作用机制：Western blot检测二甲双胍能够抑制HER2蛋白表达,下调其下游P13K的表达水平降低Akt、mTOR的磷酸化,进而抑制下游4E-BP1及p70S6K的活化。(三)二甲双胍与靶向药物曲妥珠单抗联合的协调作用：1) CCK-8检测单纯使用靶向药物曲妥珠单抗(100ug/ml)在不同时间点对HER2阳性胃癌细胞NCI-N87、OE19的增殖均无抑制作用。2)CCK-8检测10、20、30、40、50 mmol/L的二甲双胍联合曲妥珠单抗干预NCI-N8724 h后细胞相对增殖率分别为1.314±0.047、1.156±0.069、1.052±0.011、1.002±0.020、0.900±0.012,干预48 h后细胞相对增殖率分别是1.728±0.115、1.427±0.036、1.243±0.033、1.076±0.018、0.761±0.022,干预72 h后细胞相对增殖率分别是2.457±0.110、2.176±0.074、1.367±±0.070、0.974±±0.034、0.602±0.033,与同浓度、单药的二甲双胍组比较,差异有统计学意义(p<0.05)；CCK-8检测相同浓度梯度的二甲双胍联合曲妥珠单抗干预OE1924 h后细胞相对增殖率分别为1.596±0.050、1.740±0.086、1.307±0.023、1.086±0.035、0.866±0.025,干预48 h后细胞相对增殖率分别是1.999±±0.047、1.872±0.044、1.435±0.085、1.073±0.019、0.527±0.055,干预72 h后细胞相对增殖率分别是2.748±0.120、2.260±0.027、1.497±±0.058、0.796±0.025、0.291±0.038,与空白组、单药曲妥珠单抗组、同浓度单药二甲双胍组相比较,差异有统计学意义(p<0.05)。结论：1)二甲双胍能够抑制HER2阳性胃癌细胞的增殖及克隆形成能力,促进细胞凋亡,阻滞细胞周期,使细胞停滞于G1期；2)二甲双胍可以下调HER2阳性胃癌细胞的HER2蛋白表达水平,并抑制PI3K/Akt/mT0R信号通路的活性；3)靶向药物曲妥珠单抗单用对HER2阳性胃癌细胞NCI-N87、OE19体外没有杀伤作用,联合二甲双胍后有明显的生长抑制作用,二者存在协同作用。