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一、研究背景随着医疗技术的进展,心血管疾病的治疗取得了突飞猛进的进步,心血管疾病仍然是影响着人类健康的头号杀手。据统计,我国心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）的现患人数约为3.3亿,其中心力衰竭约为（heart failure,HF）890万,慢性心力衰竭是心血管疾病的临床终末阶段,而心肌梗死（myocardial infarction,MI）仍然是心力衰竭的常见主要原因。自经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention,PCI）被广泛应用到临床后,心肌梗死后心力衰竭的患病率显著下降。然而,心肌梗死后心力衰竭的现象仍然很普遍。心肌梗死后心力衰竭归属于祖国医学“胸痹”、“喘证”、“水肿”等类似,基本病机为本虚标实,其主要证型为阳虚血瘀证,治法当以扶阳益气,活血化瘀为要,佐以温肾利水,平喘祛痰等法。导师总结多年的临床经验,以扶阳活血为主要治则,兼益气、养阴、利水、祛痰等法,凝练有效经验方剂药物组成如下:制附子10g,黄芪30g,太子参15g,干姜9g,桂枝9g,红花9g,赤芍12g,川芎10g,薤白15g,麦冬12g,五味子10g,茯苓15g,生牡蛎30g（先煎）,炙甘草10g。该方临床疗效确切,但作用机制有待进一步探索。心肌细胞凋亡导致的心肌细胞丢失被认为是心力衰竭时心室功能持续下降的原因之一,心肌细胞是终末分化的,随着心肌细胞的减少,心肌维持收缩功能的能力降低。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶（也称为蛋白激酶B/PKB）,可通过抑制促凋亡蛋白和促进抗凋亡信号传导来防止细胞凋亡,在心血管疾病中作为心脏重要保护因子存在,延缓心肌组织的重塑,保护受损心肌细胞,具有抗炎、抗纤维化、抗凋亡等作用。CREB是一种环磷腺苷效应元件结合蛋白,CREB家族成员在心肌细胞生物学和心力衰竭中发挥重要作用,与心衰发病机制相关的CREB心肌靶基因包括Bcl-2,Bcl-2家族成员是细胞线粒体凋亡途径中的重要调节因子,受AKT信号通路的调控,可决定线粒体是否应该启动细胞死亡计划并释放促凋亡因子,在调节心肌细胞凋亡中起关键作用,且抗凋亡蛋白已被证明可以预防各种心脏病理过程。二、研究目的温阳活血方治疗心肌梗死后心力衰竭临床疗效明确,本项目将以心肌梗死后心力衰竭大鼠为研究对象,通过检测大鼠心脏超声以及血浆BNP水平的方法探讨温阳活血方对心肌梗死后心力衰竭大鼠的改善作用,从病理组织形态学以及分子基因的水平探讨其通过AKT-CREB-BCL-2通路抑制心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的机制,阐明扶阳活血理论治疗心肌梗死后心力衰竭的科学内涵。三、研究方法取100只7周龄成年Wistar大鼠,构建动物心肌梗死后心力衰竭模型的方式为冠状动脉左前降支（left anterior descending,LAD）结扎法,喂养四周后经超声心动图筛选造模成功大鼠46只,将造模成功的大鼠随机分成温阳活血方高、中、低剂量组各10只,心肌梗死后心力衰竭模型组8只以及卡托普利组8只,采用穿孔不结扎法制备假手术组10只,共6组56只,连续给药8周。取材前用B超检测大鼠心功能,取材后用酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测大鼠血浆BNP水平,用精准天平称量大鼠的体重和心脏体重并计算不同组大鼠的脏体比,用HE观察心脏组织形态学改变,Masson染色计算胶原容积分数（Collagen volume fraction,CVF）,观察大鼠心肌组织内胶原组织的情况,用TTC染色观察大鼠心肌梗死面积的变化,并计算各组大鼠心肌梗死面积百分比,经实时荧光定量PCR法检测AKT1、CREB、BCL-2在大鼠心脏肌肉组织中的表达水平,蛋白免疫印迹（western blot,WB）法检测心脏组织AKT1、CREB、BCL-2的蛋白表达水平。四、研究结果（1）心脏功能各指标比较的结果:模型组与假手术相比,LVEF、LVFS呈显著下降趋势（P＜0.05）;温阳活血方各剂量组、卡托普利组与模型组比较,LVEF、LVFS均显著升高（P＜0.05）。心脏结构比较:模型组与假手术相比,LVIDd和LVIDs均显著增高（P＜0.05）;与模型组比较,温阳活血方各剂量组、卡托普利组均能明显降低LVIDs和 LVIDd（P＜0.05）。（2）血浆BNP比较:与假手术相比,ELISA测得的模型组血浆B型利钠肽（BNP）水平显著增高（P＜0.05）;与模型组比较,温阳活血方低、中、高剂量组和卡托普利组有明显降低（P＜0.05）。（3）大鼠心脏质量比较:模型组心脏质量和脏体比与假手术组比较差异显著升高（P＜0.05）;与模型组相比,温阳活血方低剂量组的脏体比显著降低（P＜0.05）。（4）病理学染色结果HE染色结果:假手术组心肌细胞结构受损不明显,罗列匀称,细胞着色均匀,心脏纤维结构排列整齐,细胞核、细胞膜边界清楚,胞浆饱满,心肌细胞的排列匀称,仅在被穿刺部位有少量疤痕组织充盈。模型组心肌细胞减少,结缔组织减少,着色深浅不一,细胞间隙宽大,排列散乱;卡托普利组与温阳活血方组心肌细胞肥大程度较模型组减轻,心肌细胞排列较为匀称,着色均匀。Masson染色结果:假手术组大鼠心肌组细胞形态较规则,排列有序,结构完整,着色均匀,几乎无胶原纤维阳性染色;模型组细胞排列紊乱,着色较浅,可见大量胶原沉积,细胞结构遭到破坏,间隙宽大;温阳活血方组和卡托普利组细胞排列较模型组更为整齐,胶原沉积较模型组减少。各组胶原容积分数比较:与假手术相比,模型组胶原容积分数明显升高（P＜0.05）;与模型组相比,卡托普利组和温阳活血方组胶原容积分数明显升高（P＜0.05）;卡托普利组与温阳活血方高剂量组比较未见明显差异（P＞0.05）。TTC染色结果:假手术组心肌组织完整,心室壁厚度均匀,心室壁未见染白部分;模型组心室腔增大,心室壁缺血部分显示为白色组织,心室壁变薄明显;温阳活血方各剂量组以及卡托普利组心室壁变薄,可见心室壁变白梗死区域,程度较模型组轻;各剂量组之间无明显区别。心肌梗死面积比较:与假手术相比,模型组大鼠心肌梗死面积明显增大（P＜0.05）;与模型组相比,卡托普利组和温阳活血方各剂量组心肌梗死面积明显减小（P＜0.05）。TUNEL染色结果显示:上图被荧光染色细胞为凋亡细胞（如下图10）,细胞计数,发现假手术组细胞凋亡率较模型组明显减少（P＜0.05）,与模型组比较,温阳活血方组以及卡托普利组细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）（5）PCR结果:与模型组相比,卡托普利组AKT1、CREB、BCL-2的表达水平显著增强（P＜0.05）;中药复方可上调CREB、BCL-2的表达（P＜0.05）,中、高剂量组可上调AKT1的表达（P＜0.05）。（6）WB结果:与模型组相比,卡托普利组大鼠心肌组织中AKT1、CREB、BCL-2的蛋白质表达水平显著升高（P＜0.05）;温阳活血方可上调AKT1、CREB的蛋白表达水平较明显（P＜0.05）,中、高剂量可上调BCL-2的蛋白表达水平（P＜0.05）。五、研究结论温阳活血方可明显改善心肌梗死后心力衰竭大鼠的心功能、提高心肌梗死后心力衰竭大鼠的射血分数并降低血浆BNP水平,改善心室重塑进程,减轻心肌纤维化程度,降低心肌梗死面积,其机制可能温阳活血方通过激活AKT/CREB信号通路,并影响其下游因子BCL-2的表达,影响心肌细胞凋亡有关。