群体感应系统能使细菌感知外界信号分子在环境中浓度的变化,进而启动或抑制一系列基因的表达,以此来监控菌群密度、调控生理功能、抵御外部不良刺激。噬菌体是细菌的“天敌”,对细菌的种群分布和数量影响巨大,是控制细菌分布与数量最为重要的生物因素之一,然而关于细菌群体感应系统如何协作宿主抵御噬菌体侵染的研究尚少有报道。论文从革兰氏阴性和阳性细菌入手,重点验证群体感应系统是否参与宿主对烈性噬菌体侵染的抵御并对其信号分子通路进行系统分析。论文首先以革兰氏阴性菌大肠杆菌和T4烈性噬菌体为模型,通过Red重组技术构建了群体感应系统AI-1、AI-2信号分子受体基因sdiA、lsrB及其下游调控因子ydiV和lsrR的基因缺陷和回补菌株,除lsrR因是细菌生长发育的必须基因无法制备缺陷株外,其余都构建成功。T4噬菌体侵染实验证明,T4对ΔydiV和ΔlsrB的侵染率产生了显著变化,其中ΔydiV下降20%,ΔlsrB上升20%;所有回补菌株都能恢复至野生型水平。因大肠杆菌AI-1系统不完整,仅有信号分子的受体基因sdiA,而无相应信号分子合成基因,因此,在无外源信号分子添加的情况下ΔsdiA菌株的感染率应该与野生型菌株一样,实验结果与推测完全一致,研究结果初步证明了大肠杆菌群体感应系统参与了宿主抵御T4噬菌体的侵染。因ΔlsrR无法构建,又存在宿主自身合成的内源信号分子的干扰,不利于对其信号通路(AI-2)的分析。因此论文重点对AI-1的信号通路进行了分析和研究,首先对AI-1类信号分子的使用条件进行了优化,结果证明C4-HSL最有效,其最适使用浓度为5μM。在经C4-HSL处理后,野生型宿主的侵染率下降15%,而ΔsdiA菌株则不受影响,回补菌株pCA24N-sdiA与野生型类似,结果确认了群体感应系统参与了宿主对噬菌体侵染的防御。论文进一步利用基因敲出和RT-PCR的方法分析了 AI-1信号通路中位于SdiA下游的多个重要基因的功能,研究表明信号分子的处理,明显使ydiV的转录水平上调,进而导致T4噬菌体吸附受体及相关基因ompC、waaA、waaQ转录水平的上调;而一旦ydiV或sdiA缺失则无法观察到同样的现象,这一结果在噬菌体吸附实验中也得到了证明。虽然实验结果表明信号分子的添加使噬菌体吸附率上升约1 3%,但最终的侵染率实验却是降低了约15%,经分析,我们认为ydiV是大肠杆菌的一个全局性调控因子,它的启动也可以激活宿主体内重要的抗噬菌体系统-CRISPR。论文进一步对CRISPR系统相关的基因leuO、hns、bglJ、rcsB和casE的功能进行了分析。研究结果表明,信号分子的添加导致编码CRISPR激活因子LeuO的调节蛋白bglJ、rcsB基因的转录水平上调,同时leuO的转录水平也得到了大幅提升,虽然LeuO的负调节因子基因hns也有部分上调,但由于leuO/hns的转录比例显著提升,最终激活了 CRISPR系统,使CRISPR系统的casE的转录水平提高了 2.4倍。为了证实这一结果,我们又构建了基因缺陷型菌株ΔleuO,结果表明leuO缺失后信号分子的添加使T4的侵染率上升了 13%,充分证明了这一假设的正确。为更好地揭示细菌群体感应与抗烈性噬菌体感染的研究,论文利用研究组已分离得到的革兰氏阳性细菌Bacillus cereus MYB41-22及其烈性噬菌体VMY22为材料开展了相关研究。首先完成了它们的全基因组测序工作,结果表明,噬菌体VMY22基因组大小为18,609 bp,GC含量为36.4%,共有25个ORF。而宿主菌MYB41-22基因组大小为4,428,864 bp,GC含量为36.06%,共有5481个预测的ORF,存在PlcR-PapR和LuxS两套群体感应系统。同时对这两套系统进行了初步检测,制定了详细的研究方案和策略并针对PlcR-PapR系统合成了相关信号分子多肽,为今后的研究工作奠定了良好基础。总之,通过以上的研究我们在世界上首次证明了革兰氏阴性细菌-大肠杆菌的群体感应系统参与了宿主防御T4噬菌体的侵染过程,其中AI-1系统的启动不但需要信号分子的存在,还需要sdiA、ydiV及leuO基因的存在,虽然信号分子的添加会导致宿主为应对外部环境的刺激增加相关膜蛋白包括噬菌体受体蛋白的合成;但它同时也会激发CRISPR系统来抵御噬菌体的侵染,而宿主最终的表现正是这两种作用角力后的结果,从我们的结果来看,显然抗噬菌体的力量占了上风。论文也尝试着对本研究组分离得到的革兰氏阳性细菌Bacillus cereus MYB41-22及其噬菌体VMY22的群体感应系统开展了研究,论文对它们的全基因组进行了测序,初步明确了群体感应系统的基因组成并对它们进行了检测,为进一步的研究奠定了基础,但限于论文作者时间和精力的限制,这一方面的进一步研究只能留待研究组的其它同学继续完成。