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氟中毒是一种地球化学性疾病,氟能够通过血脑屏障对大脑产生毒害作用,造成中枢神经系统的功能障碍。近年来,高氟损伤机体神经系统的研究已经成为氟中毒研究领域的热点。课题组前期研究发现氟中毒可以降低子代大鼠学习记忆能力,大脑皮质和海马结构损伤,出现病理学改变,神经细胞凋亡率升高,DNA损伤严重等现象。神经细胞体外培养的成功为神经系统疾病的研究提供了很好的细胞模型,神经细胞也广泛应用于神经细胞毒性效应和神经毒性作用机制的研究。为了进一步丰富氟中毒理论,本试验以体外培养SD大鼠大脑皮质神经细胞为研究对象,采用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mmol/L5个不同浓度的氟化钠(NaF)进行细胞攻毒试验,研究不同浓度氟化钠对神经细胞形态、细胞活性、细胞骨架及细胞内微管相关蛋白MAP2表达的影响。本试验应用新生3天以内的SD乳鼠作为试验材料,无菌分离大脑皮质神经细胞,以DMEM完全培养基培养,待4h细胞贴壁后更换为无血清培养基Neurobasal,第3d半量换液,建立稳定的SD大鼠大脑皮质神经细胞体外培养体系。神经细胞于培养第7天采用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mmol/L5个不同浓度的氟化钠(NaF)进行细胞攻毒试验,攻毒24h后观察神经细胞形态学和细胞超微结构变化；同时采用考马斯亮蓝R250对神经细胞骨架进行染色,观察5个不同浓度梯度的氟化钠(NaF)对神经细胞骨架的影响；MTT方法测定五个不同浓度梯度氟化钠(NaF)对神经细胞细胞活性的影响；免疫荧光方法检测不同浓度NaF攻毒后细胞内MAP2表达的变化。原代神经元培养结果显示：神经细胞以高糖DMEM完全培养基种板,4h后更换为Neurobasal培养基。培养4h后细胞已经贴壁生长,细胞呈圆形,折光性好；24h后部分细胞长出细小的神经突起；第三天细胞胞体变大,胞体饱满,细胞之间开始形成细胞网络结构；第五天细胞胞体继续增大,细胞网络非常明显；第七天细胞胞体更大,光晕明显,突起粗而长,形成完整的神经网络结构。尼氏染色(Nissl’s staining)试验鉴定结果显示,体外培养成功获得大脑皮质神经细胞,可以用于试验。高氟对神经细胞形态学毒性影响研究结果显示：0.5、1.0、1.5mmol/L NaF组神经细胞细胞形态变化不明显；而在2.0mmol/L和2.5mmol/L试验组中,细胞突起出现断裂,细胞损伤严重。扫描电镜观察发现：随着氟剂量的增加,细胞突起出现皱缩、甚至断裂。透射电镜观察发现：对照组神经细胞核膜清晰,线粒体嵴清楚；氟处理组线粒体肿胀,染色质边集、核周隙增宽、核膜损坏、线粒体嵴断裂甚至消失。细胞骨架显色试验结果显示：0.5、1.0、1.5mmol/L试验组,细胞骨架清晰、淡染；而2.0mmol/L和2.5mmol/L试验组神经细胞骨架模糊、紊乱,出现断裂。MTT比色法检测细胞活性试验结果显示：与对照组相比,0.5mmol/L试验组神经细胞存活率较对照组差异不显著(P>0.05)；1.0mmol/L试验组细胞存活率显著降低(P<0.05),1.5、2.0、2.5mmol/L试验组细胞存活率极显著降低(P<0.01)。免疫荧光试验结果显示：MAP2主要在神经细胞胞体和突起中表达,与对照组相比,0.5、1.0、1.5mmol/L NaF对MAP2表达影响不明显,而2.0mmol/L和2.5mmol/L NaF使神经细胞内MAP2表达量下降。上述研究结果表明,高氟对体外培养大鼠大脑皮质神经细胞形态、细胞存活率及细胞骨架均具有明显的毒性作用,且存在明显的剂量依赖性,氟浓度越大,细胞毒性越严重。