鹅FSH-α基因mRNA表达规律及原核表达研究

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鹅的繁殖力低下一直是困扰鹅产业发展的关键问题,其核心在于鹅节律性排卵周期长,且具有间隙期。促卵泡激素(FSH)作为调节家禽卵泡发育重要的候选基因,越来越多研究表明,FSH在家禽体内主要促进次成熟卵泡合成孕酮,作用于小卵泡促进雌激素大量生成,从而促使卵泡发育成熟。本研究在探讨促卵泡激素(FSH)基因及其负反馈调节基因卵泡抑制素(INH)共同在鹅生殖周期内表达变化规律基础上,深入阐明FSH在调控鹅产蛋过程中的作用。同时利用融合PCR技术,将具有延长基因半衰期作用的CTP序列添加到鹅FSH基因各亚基的C末端进行基因融合,通过构建原核表达载体,获得了pET32a-FSH α-CTP、pET32a-FSH β-CTP和pET32a-FSH β-CTP-α重组蛋白,以期为开发出鹅rFSH生物制剂奠定基础,也为提高鹅产蛋量提供依据。采用RT-PCR和RT-qPCR技术检测FSH-α、INH-α在鹅的不同组织中以及不同生殖时期的mRNA表达量。结果表明,鹅FSH-α和INH-α基因mRNA在心、肝、脾、下丘脑、肾、大肠、小肠、大脑、小脑、输卵管、腺胃、垂体、肺、卵巢和胸肌等组织中均有不同程度的表达,且在垂体、卵巢等生殖相关组织中表达较高。不同生殖时期的mRNA表达量检测发现,FSH-α基因表达量在产蛋期(排卵前)达到顶峰,显著高于另外三个时期(开产前期、产蛋期(排卵后)、抱窝期);INH-α基因表达量表现出与FSH-α相反的趋势,在产蛋期(排卵前)达到最低值,研究揭示了鹅FSH-α和INH-α基因在鹅不同生殖时期的变化规律。根据NCBI上公布的鹅FSH基因序列和原核表达载体pET32a的特点,设计了去除目的基因信号肽和含有酶切位点的特异性引物,经融合PCR扩增获得了目的基因FSH a-CTP、FSH β-CTP和FSH β-CTP-α,通过构建原核表达载体pET32α-FSHα-CTP. pET32α-FSH β-CTP和pET32α-FSH β-CTP-α,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测,蛋白纯化。结果表明,三个融合蛋白FSH α-CTP、FSH β-CTP和FSH β-CTP-α的IPTG最佳诱导时间分别为4h、5h和5h,最佳诱导浓度分别为0.2mmol/L,0.8mmol/L和1.5mmol/L,且都是以包涵体形式存在,分子量分别为32KD、35KD和46KD,与预期大小一致。研究结果为开展鹅FSH的基因免疫研究和鹅rFSH生物制剂研发奠定基础。
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