目的 增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是有多种炎性因子、炎症细胞和眼内细胞参与的损伤修复过程，存在着细胞增生与死亡的失衡。而视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞是其中主要的增生细胞。目前，PVR确切发病机理不清。因此，深入了解RPE细胞增生与凋亡的调控，对防治PVR及其它相关眼病有重要意义。syndecan-1为跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans，HSPG)家族成员，通过硫酸乙酰肝素与胞外配体结合，主要功能有参与细胞与胞外基质及细胞间的黏附，维持细胞的表型分化，并与细胞的移行有关。survivin为凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的新成员，是迄今发现最强的凋亡抑制因子，在胚胎发育期间和几乎所有被研究的肿瘤组织中表达，终末分化组织表达下降或不表达。survivin可促进细胞的增生、抑制凋亡，参与调节细胞的有丝分裂及血管生成。但关于syndecan-1及survivin在RPE细胞的表达及影响尚未见报道。 在本研究中，我们的目的是：(1)观察syndecan-1在PVR增生膜中的表达；正常及不同细胞因子刺激后培养的人RPE细 第四军医大学硕士学位论文胞syndeean一l的表达变化及可能通路的研究:syndeean一表达的变化对RPE细胞勃附力的影响;(2)Survivin在PVR增生膜中的表达:survivin在RPE细胞中的表达及其反义寡核昔酸 (ASON)对RPE细胞增生与凋亡的影响。方法 1.(1)免疫组织化学法和免疫荧光染色法检测正常眼球切片及PVR增生膜中syndecan一1的表达。(2)免疫荧光染色法、逆转录聚合酶链反应(RT一PcR)检测正常RPE细胞syndecan一1蛋白及mRNA的表达;免疫荧光法定性、定量观察不同刺激因子作用下syndeean一l的表达变化，包括:不同浓度(7，3 5 ng/ml)TNF一刺激24h，不同浓度(1，6卜g/ml)LPS刺激1 lh，7 ng/mlTNF一Q刺激不同时间(0一24h，每Zh为一个时间点，共13个)，30%THP一l细胞上清刺激3h、1 4h、43h;2种MAPK通路阻滞剂预先处理Zh后对30%THP一1细胞上清作用的干预。(3)30%THP一1细胞上清刺激细胞3h后0.25%胰酶作用5 min，MTT法测定细胞的豁附力。 2.(1)免疫组织化学法检测PVR增生膜标本中S盯vivin的表达。(2)免疫细胞化学法和RT一PCR检测正常RPE细胞survivin蛋白和mRNA的表达，不同浓度硫代ASON转染RPE细胞6h后继续培养19h，光镜、HE染色观察细胞形态变化，MTT法测定细胞增生，流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡的变化。结果 1.(l)syndecan一l在正常人视网膜RPE层、内外核层表达强阳性，在光感受器内节、内外丛状层、神经节细胞层及神经纤维层表达中度阳性;25例增生膜中，10例表达阳性，其中4例中等阳性，6例弱阳性。阳性染色位于细胞胞浆及胞膜中。(2)在正常RPE细胞，可检测到syndecan一1蛋白和mRNA的表达; 第四军医大学硕士学位论文未受刺激的RPE细胞胞膜/胞浆、核仁呈现强的黄绿色荧光;随TNF一。、LPS刺激浓度及时间增加，荧光强度呈减弱趋势(p<0.01);30%THP一l细胞上清刺激3h、14h、43h，RPE细胞荧光强度明显减弱(尸<0.001)。ERKI/2途径抑制剂(PDo98o59，50协M)和全MApK通路抑制剂(SB202474，20，50，1 00林M)预处理Zh后可部分阻断30%THP一1细胞上清对RPE细胞syndeean一l的下调作用，其中1 00林M SB202474阻断率最大，为77.4%。(3)与正常细胞相比，THP一1细胞上清作用3h后细胞勃附力下降。 2.(l)10例PVR增生膜标本中，6例Survivin表达阳性。阳性染色位于细胞胞浆/胞膜中。(2)正常人RPE细胞表达survivin蛋白和mRNA。不同浓度(300，500，700 nM)ASON转染后细胞抑制率分别为10.1%、24.2%、45.6%，呈剂量依赖性;凋亡率分别为5.27%、7.18%、9.29%。HE染色观察到细胞胞体变小，胞核浓缩碎裂，可见凋亡小体。结论 1.与正常人视网膜相比，PvR增生膜中syndecan一1表达减低或消失;与其实验结果一致，TNF一Q和LPS可下调体外培养的人RpE细胞syndeean一l的表达;30%THP一l细胞上清可下调RPE细胞syndecan一1的表达、降低细胞勃附力，且该作用至少部分通过MAPK通路。 视网膜脱离形成后，视网膜下液中含有多种生长因子。根据我们的实验结果，提示，视网膜裂孔形成后，在一些炎性因子的刺激下，RPE细胞syndecan一1的表达下调，细胞与细胞间、细胞与细胞外基质的勃附力降低，同时在视网膜下液中含有多种蛋白水解酶，在多种刺激因子作用下.，RPE细胞易于从原位游离，获得增生能力，移行并大量增生，在PVR的形成中发挥重要作用。 2.PVR增生膜中检测到survivin基因的表达，说明survivin 第四军医大学硕士学位论文可能在PVR的形成中起一定作用。survivin的表达可促进RPE细胞增生、抑制其凋亡，通过survivin ASON可能抑制RPE细胞增生、诱导凋亡，这为抑制RPE细胞增生提供了一条新的思路。