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苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH, EC1.1.1.37)利用NAD+或NADP+为辅酶催化苹果酸(malate)与草酰乙酸(oxaloacetate, OAA)之间的相互转化，是细胞内三羧酸循环关键性调控酶之一，其同工酶参与细胞内天冬氨酸生物合成、苹果酸-天冬氨酸穿梭、糖异生及脂肪生成等多个重要生理代谢过程。
本研究通过基因重组等方法在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MDH(BsMDH)基因，亲和层析纯化得到BsMDH蛋白。凝胶过滤层析和MALDI-TOF-MS检测以及SDS-PAGE分析表明，溶液中BsMDH是一个由两个分子量约为35kDa亚基组成的同源二聚体，全酶分子量约为70kDa。已有的研究显示，革兰氏阳性细菌芽孢杆菌属MDH为四聚体MDH，本研究首次发现芽孢杆菌属细菌中的枯草芽孢杆菌MDH(BsMDH)为同源二聚体。酶学性质分析显示，BsMDH催化反应的最适pH约为8.0；最适温度约为38℃。BsMDH的热稳定性较差，在30-40℃之间温浴20min，酶的残余活性可维持在原有活性75%以上，55℃及以上温度下温浴20min后，BsMDH即失去80%以上活性。BsMDH为非金属离子依赖型脱氢酶，且Na+、K+、Co2+、Cu2+、Zn2+等金属离子以及DTT、EDTA和嘌呤类核苷酸等小分子代谢物均对该酶活性呈现不同程度的抑制作用，在Rb+和Li+存在下该酶会完全失去催化活性。酶动力学检测结果显示，BsMDH在体外催化反应时表现为NAD+辅酶依赖性，其对NADH和NAD+的Km分别是55.0μM和176.8μM，对底物OAA和malate的Km分别是970.8μM和285.7μM，对NADH表现出较高的亲和性和催化效率。
为了实现BsMDH辅酶特性从NAD+向NADP+的转换，本研究通过对BsMDH与叶绿体NADP+-MDH进行基于氨基酸序列的二级结构对比分析，找出BsMDH中对应于NADP+-MDH的辅酶特异性结合位点，针对这些辅酶结合位点，设计了6个BsMDH突变方案(BsMDH-T1a、BsMDH-T1b、BsMDH-T3、BsMDH-T4、BsMDH-T5、BsMDH-T7)，并通过DNA定点突变技术得到相应的突变体BsMDH基因。突变体蛋白质表达纯化后通过圆二色谱检测，确定突变体蛋白中掺入的几个氨基酸位点突变并没有对BsMDH的结构产生明显影响。进一步的酶动力学检测显示，上述6个突变体中BsMDH-T3、BsMDH-T4、BsMDH-T5、BsMDH-T7均不同程度的实现了辅酶特性从NAD+向NADP+的转换。其中BsMDH-T3对NADPH的催化效率提升了80多倍，且对NADPH的偏好性提高了376倍。而突变体BsMDH-T4和BsMDH-T5对NADH的亲和力明显下降，对NADPH的亲和力和催化效率显著提升。与野生型BsMDH相比，BsMDH-T7对NADH的亲和力下降了近5倍，对NADPH的亲和力提升了31倍，且实现了从野生型BsMDH在NADP+为辅酶时几乎没有催化活性，到突变后对NADP+的偏好性提升了734倍，比对NAD+偏好性的高近10倍。由酶的专一性常数(kcat/KmNADH/kcat/KmNADPH)显示，野生型BsMDH对NADH偏好性是对NADPH的224.3倍，而突变后BsMDH-T7的(kcat/KmNADH/kcat/KmNADPH)由224.3降为0.11可知，辅酶特异性由NADH向NADPH转换了近2039倍。这表明通过BsMDH中几个关键氨基酸位点的改变，可以实现BsMDH辅酶特异性从NAD+向NADP+的转换。
现有的MDH系统演化分析显示，叶绿体NADP+-MDH似乎是从胞质NAD+-MDH演化而来，且其祖先可能是古代蓝藻MDH，但目前这一演化假说尚未有明确的实验性依据，是一个悬而未决的科学问题。BsMDH处在系统演化分析中由胞质NAD+-MDH向叶绿体NADP+-MDH演化的中间过渡位置。本研究从对革兰氏阳性模式菌株BsMDH进行酶学及辅酶特异性研究入手，同时在体外实现对BsMDH的辅酶特异性转换，以验证MDH家族中辅酶特异性可转变规律的普遍性。同时，实验结果暗示，在MDH的演化过程中，几个关键位点氨基酸序列的改变就足以使得胞质NAD+-MDH的辅酶特异性由原来的NAD+转变为NADP+，从而具有演化成现代的叶绿体NADP+-MDH的可能。因此，本研究结果可为初步探讨叶绿体NADP+-MDH的演化假说提供一个有力的分子生物学依据。
本研究通过基因重组等方法在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MDH(BsMDH)基因，亲和层析纯化得到BsMDH蛋白。凝胶过滤层析和MALDI-TOF-MS检测以及SDS-PAGE分析表明，溶液中BsMDH是一个由两个分子量约为35kDa亚基组成的同源二聚体，全酶分子量约为70kDa。已有的研究显示，革兰氏阳性细菌芽孢杆菌属MDH为四聚体MDH，本研究首次发现芽孢杆菌属细菌中的枯草芽孢杆菌MDH(BsMDH)为同源二聚体。酶学性质分析显示，BsMDH催化反应的最适pH约为8.0；最适温度约为38℃。BsMDH的热稳定性较差，在30-40℃之间温浴20min，酶的残余活性可维持在原有活性75%以上，55℃及以上温度下温浴20min后，BsMDH即失去80%以上活性。BsMDH为非金属离子依赖型脱氢酶，且Na+、K+、Co2+、Cu2+、Zn2+等金属离子以及DTT、EDTA和嘌呤类核苷酸等小分子代谢物均对该酶活性呈现不同程度的抑制作用，在Rb+和Li+存在下该酶会完全失去催化活性。酶动力学检测结果显示，BsMDH在体外催化反应时表现为NAD+辅酶依赖性，其对NADH和NAD+的Km分别是55.0μM和176.8μM，对底物OAA和malate的Km分别是970.8μM和285.7μM，对NADH表现出较高的亲和性和催化效率。
为了实现BsMDH辅酶特性从NAD+向NADP+的转换，本研究通过对BsMDH与叶绿体NADP+-MDH进行基于氨基酸序列的二级结构对比分析，找出BsMDH中对应于NADP+-MDH的辅酶特异性结合位点，针对这些辅酶结合位点，设计了6个BsMDH突变方案(BsMDH-T1a、BsMDH-T1b、BsMDH-T3、BsMDH-T4、BsMDH-T5、BsMDH-T7)，并通过DNA定点突变技术得到相应的突变体BsMDH基因。突变体蛋白质表达纯化后通过圆二色谱检测，确定突变体蛋白中掺入的几个氨基酸位点突变并没有对BsMDH的结构产生明显影响。进一步的酶动力学检测显示，上述6个突变体中BsMDH-T3、BsMDH-T4、BsMDH-T5、BsMDH-T7均不同程度的实现了辅酶特性从NAD+向NADP+的转换。其中BsMDH-T3对NADPH的催化效率提升了80多倍，且对NADPH的偏好性提高了376倍。而突变体BsMDH-T4和BsMDH-T5对NADH的亲和力明显下降，对NADPH的亲和力和催化效率显著提升。与野生型BsMDH相比，BsMDH-T7对NADH的亲和力下降了近5倍，对NADPH的亲和力提升了31倍，且实现了从野生型BsMDH在NADP+为辅酶时几乎没有催化活性，到突变后对NADP+的偏好性提升了734倍，比对NAD+偏好性的高近10倍。由酶的专一性常数(kcat/KmNADH/kcat/KmNADPH)显示，野生型BsMDH对NADH偏好性是对NADPH的224.3倍，而突变后BsMDH-T7的(kcat/KmNADH/kcat/KmNADPH)由224.3降为0.11可知，辅酶特异性由NADH向NADPH转换了近2039倍。这表明通过BsMDH中几个关键氨基酸位点的改变，可以实现BsMDH辅酶特异性从NAD+向NADP+的转换。
现有的MDH系统演化分析显示，叶绿体NADP+-MDH似乎是从胞质NAD+-MDH演化而来，且其祖先可能是古代蓝藻MDH，但目前这一演化假说尚未有明确的实验性依据，是一个悬而未决的科学问题。BsMDH处在系统演化分析中由胞质NAD+-MDH向叶绿体NADP+-MDH演化的中间过渡位置。本研究从对革兰氏阳性模式菌株BsMDH进行酶学及辅酶特异性研究入手，同时在体外实现对BsMDH的辅酶特异性转换，以验证MDH家族中辅酶特异性可转变规律的普遍性。同时，实验结果暗示，在MDH的演化过程中，几个关键位点氨基酸序列的改变就足以使得胞质NAD+-MDH的辅酶特异性由原来的NAD+转变为NADP+，从而具有演化成现代的叶绿体NADP+-MDH的可能。因此，本研究结果可为初步探讨叶绿体NADP+-MDH的演化假说提供一个有力的分子生物学依据。