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猪呼吸与繁殖综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是一种引起猪繁殖障碍和呼吸系统疾病的重要病原。该病毒的爆发和传播给全世界范围内的猪业带来很大的经济损失。PRRSV属于尼多病毒目,动脉炎病毒科,是单股正链的RNA病毒,具有囊膜。PRRSV包括两种基因型型:欧洲型（或PRRSV-1型）和美洲型（或PRRSV-2型）。在我国主要流行的是美洲型,关于欧洲型的报道很少。PRRSV的天然宿主是猪肺泡巨噬细胞（PAM）,除PAM细胞之外,非洲绿猴肾细胞（MARC-145）也是常用的分离和培养PRRSV的细胞系。PRRSV感染宿主细胞的主要方式是通过受体介导的网格蛋白的内吞作用。CD163（SRCR）是重要的PRRSV受体,并且决定病毒的细胞嗜性。另一个不可或缺的细胞因子是非肌肉肌球蛋白重链II型A（NMHC IIA或MYH9）。唾液酸粘附素（Sialoadhesion,Sn,CD169）、似肝磷脂蛋白（Heparan sulphate,HS）、波形蛋白Vimetin、CD151和树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3非整合素（DS-SIGN,CD209）也在PRRSV吸附感染过程中也发挥了重要的作用。MYH9是一种细胞骨架蛋白,参与细胞迁移,细胞有丝分裂,囊泡的转移和分泌和细胞内分子在微丝束上的移动等。MYH9是本实验室前期利用PRRSV GP5蛋白的抗独特性抗体Mab-5G2通过免疫共沉淀和质谱测序鉴定出来一个新的PRRSV细胞受体。根据C端序列的差异,将MYH9分为三种亚型:包括NMHC IIA（MYH9）、IIB（MYH10）和IIC（MYH14）。前期实验证明MYH9的C端（命名为PRA）特异性地与PRRSV的GP5蛋白结合并且促进病毒的进入。进一步研究发现MYH9可以通过与CD163的协同作用促进病毒进入宿主细胞。本论文的研究目的是研究MYH9与PRRSV GP5的特异性相互作用和形成的复合物的形态,以及在PRRSV早期感染宿主细胞过程中的作用。本研究的内容如下:1.PRRSV SD16毒株GP5截短蛋白的研究。构建原核表达质粒:pET-28a-GP5Δ-His并在E.coli中表达得到包涵体,利用梯度尿素进行包涵体复性,GP5Δ-His蛋白孵育MARC-145和PAM细胞,然后再感染SD16病毒,发现GP5Δ-His蛋白可以阻断大部分病毒的感染。利用相同的原核系统表达方式,得到GP5-ecto-1-His和GP5-C-His蛋白,同时做病毒阻断实验,实验结果表明,只有GP5-ecto-1可以阻断病毒的感染,而且对其他的毒株（JXA1、VR2332、P073-3和GZ11-G1）的感染,除了CH-1a毒株以外,有相同的抑制作用。通过分析CH-1a毒株的GP5-ecto-1序列,我们发现在F39位氨基酸的侧链具有与其他病毒不同的苯环。因此,GP5-ecto-1蛋白对大部分PRRSV毒株有阻断感染的作用,而且GP5-ecto-1是病毒粒子感染宿主细胞的关键区域。2.GP5与MYH9相互作用的研究。纯化的GP5Δ-His蛋白,与实验室原本保存的原核表达的PRA蛋白分别结合在ELISA 96孔板或PVDF膜上作为“诱饵蛋白”,再用PRA或GP5Δ-His孵育,5G2或anti-His抗体用来检测结合的蛋白。与无关蛋白sp239蛋白相比,GP5Δ-PRA或PRA-GP5Δ有明显的相互作用。为了进一步研究GP5Δ和PRA之间的相互作用是否有糖基化的参与,利用实验室前期构建的稳定表达GP5的细胞系MARC-145-GP5Flag,裂解后用PNGaseF或Neuraminidase药物处理细胞除去GP5表面的糖基化和唾液酸修饰,然后用anti-Flag抗体结合GP5,并沉淀出细胞系天然存在的MYH9。总而言之,GP5-MYH9的相互作用既有线性表位,也有构象表位的参与,而且GP5的糖基化和唾液酸修饰不影响蛋白之间的结合。为了找到GP5结合MYH9的区域,我们利用co-IP和His pull down实验发现,只有GP5和GP5-N可以与MYH9（或PRA）结合,而GP5-C不能与MYH9（或PRA）结合。Far western的实验结果进一步说明,GP5-ecto-1可以与PRA直接结合。GP5-ecto-1可以诱导MARC-145细胞内的MYH9聚集,而且,在细胞外表达的GP5-ecto-1/PRA蛋白复合物中,PRA形成粗的蛋白束,但是PRA和GP5-C/PRA复合物并没有出现这样的现象。将S100A4加入GP5-ecto-1/PRA复合物中时,PRA的蛋白束发生解聚。除此以外,co-IP和His pull down实验也发现,S100A4通过与GP5-ecto-1竞争性地结合MYH9（或PRA）,从而导致MYH9（或PRA）的解聚。3.MYH9介导PRRSV入侵的研究。将50 MOI SD16毒株吸附并感染MARC-145细胞和PAM细胞。细胞转入37℃后的0 min,5 min,15 min和30 min分别收集细胞并用激光共聚焦显微镜观察。在15 min时,细胞内MYH9聚集并且与PRRSV发生共定位（MARC-145细胞,在PAM细胞中是15 min和30 min）。同时,PRRSV的N蛋白水平在15 min有明显的提高。这些发现表明MYH9多聚体在PRRSV内化过程中发挥重要的作用。通过qPCR,western blot和激光共聚焦实验,发现内源性S100A4在PRRSV感染过程中没有明显的变化。在MARC-145细胞中过表达S100A4,PRRSV SD16毒株的早期内化（感染后30 min内）被显著地抑制。而且对其他PRRSV的毒株也有相同的抑制作用。以上结果表明,S100A4具有潜在的抗病毒作用。综上所述,本研究表明,GP5触发MYH9形成多聚体结构,并且MYH9聚集体在PRRSV的内化和进一步感染中发挥了重要的作用。本研究也为PRRSV感染的机制提供了新的内容和研究方向。