【摘 要】
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近年来发现鱼类L-氨基酸氧化酶（L-amino acid oxidase,LAAO）对多种病原在体外具有显著的杀灭活性,但鱼类LAAO在体内应对病原感染的分子机制尚未有深入研究,本研究开展了模式动物斑马鱼（Danio rerio）L-氨基酸氧化酶介导的应答无乳链球菌感染机制初步研究。斑马鱼LAAO（ZF-LAAO）的生物信息学分析结果表明,ZF-LAAO是一种分子质量约为56 k Da,拥有两个N
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近年来发现鱼类L-氨基酸氧化酶（L-amino acid oxidase,LAAO）对多种病原在体外具有显著的杀灭活性,但鱼类LAAO在体内应对病原感染的分子机制尚未有深入研究,本研究开展了模式动物斑马鱼（Danio rerio）L-氨基酸氧化酶介导的应答无乳链球菌感染机制初步研究。斑马鱼LAAO（ZF-LAAO）的生物信息学分析结果表明,ZF-LAAO是一种分子质量约为56 k Da,拥有两个N糖基化位点和两个O糖基化位点的同源二聚体胞外分泌蛋白,主要定位在内质网中。将ZF-LAAO与已报道的硬骨鱼类LAAO建立系统发育树,发现ZFLAAO与鱇浪白鱼LAAO相似度高达79.45%,且LAAO在目的水平体现出明显的物种差异;通过q RT-PCR分析了斑马鱼在感染无乳链球菌后LAAO的表达谱,结果显示ZF-LAAO表达在细菌感染后6 h内显著上调,在12 h达到最高,其表达量显著高于溶菌酶;构建了3株ZF-LAAO原核系统异源表达菌株AE-p ET28-LAAO、AE-p ET32-LAAO和AE-p Cold TF-LAAO,分别获得了约60、70和120 k Da的重组蛋白。质谱鉴定结果表明,重组蛋白为目的蛋白ZF-LAAO。重组蛋白可溶性分析结果表明,AE-p ET28-LAAO与AE-p ET32-LAAO皆以包涵体形式表达重组蛋白,AE-p Cold TF-LAAO可以表达可溶ZF-LAAO重组蛋白。通过重组蛋白免疫小鼠,成功制备了可识别ZF-LAAO的多克隆抗体,该抗体可以识别斑马鱼肝脏的天然蛋白LAAO;利用CRISPR/Cas9技术得到了ZF-LAAO敲除斑马鱼;通过对无乳链球菌攻毒前后的野生型斑马鱼和LAAO敲除斑马鱼的肝、鳃、脾进行了转录组分析,LAAO敲除斑马鱼与野生型斑马鱼相比,在肝脏组织中检测到5 260个上调差异基因,3 081个下调差异基因,在鳃组织中检测到1 725个上调差异基因,2 612个下调差异基因;在无乳链球菌攻毒后,在肝脏组织中检测到899个上调差异基因,872个下调差异基因,在鳃组织中检测到1 118个上调差异基因,794个下调差异基因,在脾组织中检测到1 374个上调差异基因,511个下调差异基因。GO分析结果表明LAAO敲除鱼与野生型斑马鱼相比,差异表达基因功能多被聚类到肌肉、核糖体及免疫相关功能;在无乳链球菌攻毒后多数差异基因被聚类到脂质代谢、免疫、线粒体、呼吸链等功能。KEGG分析结果表明,无论是LAAO敲除后与野生型斑马鱼相比的本底水平差异表达基因还是攻毒后二者的差异表达基因,均富集到氨基酸代谢及合成相关通路、糖类代谢相关通路以及脂质相关通路,免疫应答相关通路则大量富集到与氧化还原相关的PPAR信号通路和谷胱甘肽代谢通路,揭示了ZF-LAAO在细胞的氧化还原平衡中发挥重要作用,参与细胞代谢及免疫功能的调控。本研究结果为进一步研究病原感染后LAAO信号调控分子网络提供了基础。
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