目的:脾气虚证是中医临床消化系统疾病常见证型,伴有胃肠道消化吸收功能紊乱、四肢无力、营养失调等症状,越来越多的研究表明,脾气虚证不仅与机体代谢有关,而且与肠道菌群有着密不可分的关系。脾气虚证患者出现胃肠道消化吸收功能紊乱表明肠道微生态失衡可能对宿主正常的代谢产生干扰。目前对脾气虚证研究的方向很多,既有代谢组学也有肠道菌群方面,但结合两者共同分析的研究很少,同时对脾气虚证肠道菌群的深入研究及其功能预测更是少之又少。近年来,随着高通量深度测序技术、分子生物学和代谢组学技术的迅猛发展,为研究脾气虚证的本质提供了全新的技术支持。本论文从分子生物学、肠道微生态学和代谢组学的角度探究脾气虚证的发病靶点,更深入地阐明脾气虚证本质,解释肠道微生态群落与宿主代谢组在脾气虚证的发病机制中的作用及为治疗脾气虚证提供有效的生物信息学数据基础。方法:1.采用“苦寒泻下+劳累力竭+饥饱失常”的方法建立脾气虚证大鼠模型。在造模期间,观察并记录大鼠体重、大便、饮食、精神状态、毛发色泽、动作变化等外在体征及脏器指数,对建立的脾气虚证大鼠模型进行综合评价。2.在成功建立脾气虚证大鼠模型的基础上,制备尿液检测样品,采用D-木糖测试盒测定两组大鼠的尿D-木糖排泄率,考察大鼠在脾气虚状态下对尿液D-木糖排泄率的大小的影响。3.在造模结束及实验结束后采血,制备血清和血浆样品,采用ELISA法测定正常组和脾气虚证模型组大鼠的磷酸肌酸激酶(CPK)的活性、胃动素(MTL)和胃泌素(GAS)含量,考察脾气虚状态下对骨骼肌受损情况、胃肠激素和肽类分泌的影响。4.制备大鼠尿液和粪便样品,采用核磁共振技术(NMR)分析两组大鼠尿样与粪样代谢物谱,对图谱进行优化处理,再根据代谢物的化学位移值、耦合常数、峰的裂解情况、参考文献及Chenomx NMR Suit软件的代谢物数据库对代谢物谱峰进行归属。然后对所得积分数据进行多元统计分析,如PCA、PLS-DA和OPLS-DA等,筛选与脾气虚证相关的差异代谢标志物,通过通路富集代谢分析,解释相关代谢通路的调控作用。5.在成功建立脾气虚大鼠模型的基础上,采用PCR-DGGE技术对大鼠粪便样品16S rRNA基因的V3区进行聚合酶链式反应(PCR)扩增联合变性梯度凝胶电泳技术(DGGE),探讨脾气虚证大鼠肠道菌群指纹图谱的影响及挖掘具体菌群。然后进一步对脾气虚证模型大鼠发生变化的肠道菌群和代谢物组进行相关性分析,深入揭示肠道菌群与宿主代谢之间的关系。6.利用Illumina Miseq测序平台对肠道菌群的V4区PCR产物进行高通量测序,将肠道微生物群落以OUT为单元进行分类以进行生物信息学分析其群落结构与多样性。通过LEfSe分析和PICRUSt分析筛选脾气虚证模型大鼠肠道菌群生物标志物并预测其功能。结果:1.经过“苦寒泻下+劳累力竭+饥饱失常”复合因素建立的脾气虚证大鼠,造模后出现泄泻、四肢不收、眯眼等症状,而且有持续现象;体重较正常组出现明显增长缓慢的状况(P<0.05);脾脏指数和胸腺指数(P<0.05)等脏器指数较正常组降低;模型组大鼠的尿D-木糖排泄率、CPK活性、血清GAS与血浆MTL水平均显著低于正常组(P<0.05)。2.代谢组学分析:尿样中共归属了 73种代谢物,粪样共归属了 60中代谢物,然后进行分段积分,再通过变化倍数法(|FC|>1.2)和统计学方法(P<0.05)筛选出脾气虚证大鼠尿液34种与粪便19种差异代谢产物。再进一步筛选出差异更显著的代谢物,尿液中有12种,其中差异代谢产物中有7种下调,5种上调,变化产物包括酮戊二酸、柠檬酸盐、甲胺类等,主要涉及三羧酸循环、牛磺酸和牛黄胆酸合成、嘌呤代谢通路等;粪便中有12种,其中差异代谢产物中有6种下调,6种上调,变化产物包括胆酸类、缬氨酸、核苷酸类等,主要涉及嘌呤代谢、初级胆汁酸生成、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等氨基酸合成通路等。3.在14天模型建立的期间,两组在菌群结构上有明显区别,并通过细菌的16S rDNAV3区基因克隆技术找出了 12条差异条带,基因序列已被GenBank收录,登录号为KY792535-792546。归属到门水平主要有厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)。其中脾气虚证模型大鼠中变形菌门下excrementihominis在脾气虚证模型组大鼠肠道中含量上升,且影响较大。4.高通量测序结果显示,其中两组大鼠肠道菌群微生物的丰度有明显区别,涵盖绝大部分细菌类群。脾气虚证模型组的α多样性较正常组要低,β多样性分析中未加权的PCoA显示两组完全分离。在门水平上主要分属1 1大门,其中主要有拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes),在正常组中出现脱铁杆菌门(Deferribacteres),在模型组中出现疣微菌门(Verrucomicrobia)。PICRUSt分析预测脾气虚证大鼠肠道菌群的改变揭示氨基酸代谢、癌症代谢通路、能量代谢、基因信息遗传过程、肠道菌群代谢及脂肪酸代谢通路等出现异常。结论:本文通过建立脾气虚证大鼠模型及生物信息学和代谢组学分析方法,详细研究机体处于脾气虚状态下的肠道菌群分布、宿主粪便与尿液的代谢组学变化,深入探讨肠道菌群与宿主代谢的相互关系,能够有效地提供肠道菌群的代谢信息,为开发各种微生物药物用于诊断与治疗提供理论基础。