将外源基因导入哺乳动物细胞并获得表达外源基因的细胞系，在生物学及基础医学研究中有着广泛的应用。动物细胞被外源基因转化通常是一种低效率的过程，在几万或几十万个细胞中仅有少数几个细胞可整和外源基因，即使对于高效率的转化方法，所产生的转化株也是少数。如何从大量的未转染的细胞中选出转化株，是基因转移技术十分关键的一环。 传统的方法中，用于哺乳动物细胞基因工程的载体通常需要外加一个遗传标记基因以便于进行选择。例如，利用载体携带的抗生素抗性基因，通过一定浓度的选择性培养基进行一段时间的加压培养，然后挑取单克隆扩大培养，经过鉴定获得所要的细胞系。但是载体中由于目的基因和抗生素抗性基因分别由不同的启动子启动，往往不能实现共同表达，所以采用传统的方法获得表达目的基因的细胞系，工作量大，所需时间也长。 免疫磁珠分选(MagneticCellSorting，MACS)技术由于其快速、高效并且具有可供利用的试剂盒等特点，目前已广泛应用于细胞的分选。此项技术基于抗体对细胞表面抗原的特异识别，将偶联在抗体上的磁珠标记在细胞上，在磁场作用下达到分离细胞的目的。我们将MACS分选技术引入到转染细胞的分选中，通过构建一个带有细胞表面标记基因CD34的双顺反子载体，使转染细胞在表达目的基因的同时表达CD34标记基因，然后通过MACS分选来获得所需的表达目的基因的细胞系。 CD34是属于Ⅰ型跨膜蛋白的磷酸糖蛋白，主要表达于造血干/祖细胞(hematopoieticstem/progenitorcell，HSC/HPC)上。我们利用从CD34+细胞中提取的RNA反转录得到的cDNA为模板，PCR扩增得到CD34的一种人工截短体形式dCD34(delectedvariantofCD34)。将其克隆入pGEM-T-easy载体中，测序证明其包含了完整的胞外域及跨膜部分，但是缺失了胞内域。 为了实现目的基因与CD34基因的共表达，我们采用内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite，IRES)序列构建了双顺反子表达载体。在上游启动子的控制下，IRES序列及与之相连的基因可同时转录，并以不依赖帽的方式启动远端mRNA的翻译，从而在同一转录本上翻译出不同的蛋白。我们将酶切得到的IRES及CD34片段分别连接入pGEM-T-easy载体，然后酶切出IRES-CD34片段，将其克隆入pcDNA3.1(+)载体，构建了双顺反子载体p3.1-IRES-CD34。此载体中在多克隆位点后包含了一个IRES序列及CD34基因，目的基因插入载体的多克隆位点后转染细胞，转染的细胞在表达目的基因的同时表达CD34基因，然后利用细胞表面带有的CD34标志，采用免疫磁珠分选的方法得到所需的表达目的基因的细胞。 为了验证这个载体在转染细胞分选中的作用，我们选择了绿色荧光蛋白(EnhancedGreenFluorescentProtein，EGFP)基因作为目的基因。利用PCR克隆技术从载体pIRES2-EGFP扩增得到EGFP，插入载体p3.1-IRES-CD34的多克隆位点，构建了载体p3.1-IRES-CD34-EGFP。将载体p3.1-IRES-CD34-EGFP利用脂质体转染法转染NIH-3T3细胞，对于瞬时转染及稳定转染的细胞分别采用了MACS分选的方法富集阳性细胞。 结果表明，对于瞬时转染的细胞，经MACS分选后，收集到的阳性细胞中表达绿色荧光蛋白的细胞百分率明显提高，在荧光显微镜下观察，有大于95％的细胞发出绿色荧光。流式细胞仪分析表明，转染细胞经MACS分选后，阳性细胞中表达CD34(PE阳性)的细胞百分率提高到了88％，表明目的基因与细胞表面标记基因CD34实现了较好的协同表达。对于稳定转染细胞的分选，亦可得到同样的结果。 另外，由于在用MACS分选细胞时，如果其中待分选的含特定表面标志的细胞含量太低(例如低于1％)，则经过一次MACS分选只能少量地提高其纯度，这时需要进行多次MACS分选才能获得较纯的细胞。对于转染效率较低的转染细胞的分选，为了能够只经过一次免疫磁珠分选即能够得到较纯的目的细胞，我们利用载体p3.1-IRES-CD34所含有的新霉素(neomycin)基因，采用了一个改进的方法。在转染细胞扩大培养的过程中，通过含有较低浓度G418的选择性培养基进行培养，杀死一部分未转染的细胞，使得表达目的基因的细胞比例升高，以提高免疫磁珠分选的分选效率。结果表明，对于转染效率较低的细胞，通过这种方法，经MACS分选后表达目的基因的细胞含量可达到95％以上。 综上，本课题提供了一种与传统方法不同的分选转染细胞的方法并构建了一个可以用于转染细胞分选的双顺反子载体，利用这个载体p3.1-IRES-CD34，对于转染细胞，均可实现快速分选(瞬时转染细胞约48hr,稳定转染10-15天)，并且获得较高纯度(95％以上)的表达目的基因的细胞。