普通小麦／长穗偃麦草不对称体细胞杂交直接产生了多种含有少量长穗偃麦草染色质的杂种渐渗系，至今已经繁育到F₁₀代，在后代株系中出现了遗传稳定的各种不同表型及性状，包括矮秆、抗盐、抗旱、抗病、高产及优良的加工品质等。SDS-PAGE分析发现：杂种后代中出现了多种在亲本小麦中没有的高分子量麦谷蛋白新亚基。体细胞杂种后代中出现如此多的变异表明其基因组存在较大的变异，研究小麦体细胞杂种渐渗系基因组变异及产生的原因是探讨体细胞杂交机制以及将杂种材料应用于小麦遗传改良的基础，但是到目前为止关于体细胞杂交后代基因组变异机理方面的研究还非常少。本实验从基因组和单个基因家族两种水平较为系统地研究小麦体细胞杂种渐渗系的基因组变异。研究内容涉及基因组重复序列的变异及引起变异的主要原因；表观遗传的变异；功能基因的表达变异；基因结构的变异及新基因来源；体细胞杂交诱导基因快速进化及与自然进化的比较等，为小麦体细胞杂交技术及育种应用提供了理论基础。本实验的主要研究结果如下：1．杂种后代基因组的SSR位点分析利用基因组SSR位点分析可以了解杂种基因组微卫星序列的多态性及其产生的原因。通过对三个杂种株系、双亲及混合愈伤组织基因组102个微卫星位点的研究，我们发现杂种渐渗系仅含有少量长穗偃麦草的SSR序列。与亲本小麦相比，三个杂种株系的SSR位点的变异率都在30％左右，杂种变异位点与亲本小麦混合愈伤组织（作为体细胞无性系变异对照）相应位点中具有一致带型的位点只占总检测位点的6.2％左右，说明可能由体细胞无性系变异导致SSR变异的位点数（6.2％）要远少于体细胞杂交过程的其他因素以及外源遗传物质渐渗到杂种基因组导致的SSR位点的变异数（26.5％）。在愈伤组织中发生变异的32个位点在杂种植株中发生变异的比率（20.7／32）要远高于愈伤组织中未发生变异的70个位点的变异率（12.3／70），这说明由体细胞无性系变异产生的变异位点在体细胞杂交中也容易发生变异，因而推测这些位点可能是小麦基因组中的易变位点。通过对部分变异的SSR位点进行克隆测序和序列比对，我们发现这些SSR位点的变异主要由重复序列中的重复基序的重复次数的变化引起。2．杂种后代基因组的AFLP和MSAP分析AFLP和MSAP已经发展为检测基因组多态性和表观遗传变异最为有效的方法。通过对杂种后代以及亲本基因组453个位点进行AFLP指纹分析，我们发现在三个杂种株系中消减的条带总数为43条，增加的条带总数为19条，杂种后代基因组中变异位点占总检测位点的4.6％，其中由体细胞无性系变异导致的位点变异率约占总检测位点的1.8％。总变异位点中，消减的位点占3.2％而增加的位点只占1.4％，后者主要由体细胞无性系变异导致（11／19）。杂种中增加的其它条带（8／19）既可能直接来源于供体长穗偃麦草，也可能由双亲DNA的重组产生，还有可能由DNA甲基化模式的变化引起，后者与我们在杂种后代中检测到较多的DNA甲基化模式的变异相吻合。在MSAP检测的122个位点中甲基化模式发生变化的位点总数约占检测位点总数的18.6％，其中12.0％的位点由低甲基化或无甲基化状态变为高甲基化状态，而另外6.6％的位点发生了去甲基化；由体细胞无性系变异导致的甲基化模式变化的位点只占总位点的6.3％。3．杂种后代的SSCP分析对特定基因进行SSCP分析能够有效地探明小麦杂种渐渗系功能基因的表达变异。通过SSCP技术我们检测了杂种后代与亲本小麦济南177中基因表达的变化，即部分同源等位基因的沉默或激活。在我们检测的这57个位点中有12.3％（7／57）的位点在杂种与亲本的叶中出现了部分同源等位基因的沉默或激活，而有8.8％（5／57）的位点在根中出现了表达变异。检测到表达变异的基因中有三个基因的编码蛋白未知功能，另外四个的编码蛋白的功能分别是磷脂酰肌醇3-，4-激酶家族蛋白；肽基脯氨酰异构酶；单脱氢抗坏血酸还原酶和1，3-8-葡聚糖合成酶。4．杂种后代新HMW-GS基因的来源通过与目前在普通小麦中研究得比较清楚的HMW-GS基因家族进行比较，可以直接、快速地了解小麦杂种渐渗系HMW-GS基因的结构变异。我们从杂种中克隆得到了5个HMW-GS新基因，从亲本小麦济南177中克隆到了4个HMW-GS基因；另外从亲本长穗偃麦草中克隆到了15个HMW-GS基因，其中有11个是新基因。通过对杂种和双亲中克隆到的所有的HMW-GS基因进行序列比对，我们发现杂种中的HMW-GS新基因有四种形成方式：（1）杂种的两个基因H11-3-3和H11-4-3直接来源于供体亲本长穗偃麦草；（2）杂种的H1Dx5基因来源于亲本小麦基因1Dx2.1的点突变；（3）杂种的H1By16和H1By8基因来源于亲本小麦基因1By9.1的复制滑动；（4）杂种的H1Dy12基因来源于双亲基因1Dy12.1和Aey2的重组。由此，我们首次从分子水平上揭示了杂种中HMW-GS新基因产生的机制，其结果与前人推测的HMW-GS基因自然进化的机制相吻合，同时我们发现基因重排也是杂种中新基因产生的一条途径。通过这些研究我们发现体细胞杂交过程在较短的时间内实现了在自然进化过程中需要漫长的时间才能完成的新基因的产生过程，这说明体细胞杂交是扩展小麦育种优质基因源的有效手段。5．长穗偃麦草中的三个基因的进化地位分析长穗偃麦草HMW-GS基因家族的进化关系有助于了解该基因家族的自然进化并可以进一步解释不同杂种渐渗系其它HMW-GS新基因的来源。在对长穗偃麦草中克隆到的15个HMW-GS基因进行系统进化树分析时我们发现，在C-末端非重复序列的进化树中，Aey8、Aey9和Aey10的C-末端非重复区与x型亚基基因聚在一个亚群内，而与其它的7个y型亚基相距较远。因此，这三个y型亚基基因的结构并不像其它的y型亚基基因那样典型。在目前已知的y型亚基中，只有Aey4、Aey8、Aey9、Aey10以及E^e、St、Ta和K基因组编码的y型亚基的N-末端非重复区含有105个氨基酸，其余的所有已知y型亚基的N-末端非重复区都只含有104个氨基酸残基。我们推测N-末端保守结构域中含有105个氨基酸的亚基基因要比含有104个的基因更加古老，Aey8、Aey9以及Aey10这几个基因可能代表了x和y型基因分化过程的一种中间状态。我们通过序列比较证实长穗偃麦草的Aey4基因可能是由Aey5和Aey10重组形成的一个嵌合基因。6．小麦近缘种HMW-GS基因的克隆为了进一步探讨小麦族HMW-GS基因的自然进化规律，我们在二倍体长穗偃麦草和二倍体拟鹅观草中分别克隆了四个和三个HMW-GS基因，另外我们还从二倍体澳洲麦草中克隆到了一个HMW-GS的编码基因。从二倍体长穗偃麦草和拟鹅观草中克隆到的5个y型亚基基因所编码蛋白的N-末端结构域都含有105个氨基酸残基，均比常规的y型亚基多出一个谷氨酰胺；澳洲麦草中克隆到的基因W2.5的编码蛋白的N-末端也含有该谷氨酰胺。通过对这些序列的比对以及进化树分析，我们确定E、St、K、Ta和W基因组是比小麦族其它基因组早分化出来的较古老的基因组，其中W基因组应该比其他四个基因组更古老，它可能是在x和y型HMW-GS基因分化以前分离出来的。我们从澳洲麦草中发现了区别于已知的x和y型亚基的一种全新类型的高分子量麦谷蛋白亚基，这是目前被发现的第三种高分子量麦谷蛋白亚基类型，在这种亚基中我们发现了迄今为止在其它HMW-GS中所没有的一种重复模块十二肽，这是继三肽、六肽和九肽以外在HMW-GS的重复区中发现的第四种重复序列。通过以上实验结果可以说明W基因组的HMW-GS基因与小麦族其它基因组的HMW-GS基因有着不同的进化历程。7．克隆的HMW-GS基因对小麦品质改良的意义通过对小麦体细胞杂种渐渗系及小麦族野生种HMW-GS基因家族的研究可以为小麦的品质育种提供优质基因源。我们克隆到的HMW-GS基因中有较多的新基因拥有改善小麦面粉加工品质的潜质。例如，杂种中克隆到的H1By8基因以及H1Dx5+H1Dy12基因对已经被证明与杂种较好的面粉加工品质相关联；从长穗偃麦草中克隆到的Aex4基因以及澳洲麦草中克隆到的W2.5基因等在其编码蛋白内部含有额外的半胱氨酸，并且W2.5拥有较大的中央重复区，使这两个新基因具备了已知优质亚基的基本特征；这些优质基因可望用于改良小麦面粉的加工品质。本实验室正在用这些新基因进行小麦的遗传转化和分子标记辅助育种，有望产生一系列高品质的种质或株系。