乙型病毒性肝炎(hepatitis B，乙型肝炎)是危害我国人民健康最严重的疾病之一，我国携带HBsAg的总人数超过1亿人。虽然已有相关疫苗和众多药物，但5%~10%的人群对现有乙型肝炎疫苗反应低下，且药物疗效难以令人满意。近年来公共卫生环境的改善，虽然使乙型肝炎的水平传播及围产期传播明显下降，然而乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)宫内感染尚无有效预防手段，且宫内感染一旦发生，出生后大多进展为慢性乙型肝炎而持续携带，严重危害个体及其周围人群的健康。此外，约5%~10%人群对疫苗不产生有效应答，在相当长的一个时期内，HBV感染人将持续存在。因此，研究HBV感染的分子机制，是寻找更加有效的疫苗和药物，并最终攻克其防治难题的重要途径。 一般认为，HBV和其他病毒类似，需要通过宿主细胞表面的受体或类似结构，进入细胞并进行自我复制。HBV受体的探索虽然已经有近20年的历史，先后发现10余种可能的蛋白质，但均未获得广泛承认。一方面表明受体研究方法仍需改进，其次提示参与HBV入侵靶细胞的分子可能不止一个。乙型肝炎的宫内感染同样涉及HBV受体问题，其机制虽不明确，胎肝细胞仍是HBV的主要靶细胞。已知乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)阳性的母亲孕早期(first trimester，0~12周)宫内感染罕见，而孕中晚期感染率显著升高。提示早期胎肝细胞由于分化程度低，未能表达HBV受体而不易感，随孕期延长而向成人肝细胞表型逐渐分化，其间表达了HBV受体分子，导致HBV入侵定植而发生宫内感染。 基于上述假设，我们设计了10种培养条件，在自行设计的无血清培养基中添加不同的细胞分化诱导物，包括表皮生长因子、肝细胞生长因子、二甲基亚砜、苯巴比妥钠、全反式维甲酸等，分离孕10周龄人胎肝细胞进行原代培养，观测肝细胞形态及功能指标变化，并定时给予HBV感染，观察能否在体外诱导胎肝细胞出现HBV易感性；为检测肝细胞内HBV 共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)，我们改进了现有的PCR检测法。在上述实验的基础上，建立了双重削减策略，以抑制性削减杂交对比HBV易感性出现前后的细胞mRNA变化，从而筛选出与HBV感染<WP=8>有关的基因序列。 主要结果如下： 1．HBV cccDNA的改良PCR检测法简便快速，敏感性及特异性均好。参考国外文献设计了跨越HBV基因组松驰环DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)单链区的PCR引物，实验表明单纯使用此种引物，在较多反应模板的情况下将不能区分cccDNA和rcDNA。我们在PCR扩增前使用单链核酸特异性的绿豆芽核酸酶(mung bean nuclease，MBN)消化模板，发现从105~102不同数量的cccDNA模板分子经过MBN消化后，均可扩增出相应条带；而105个rcDNA样品经过MBN消化后无法扩增任何相应条带。提示MBN预处理显著提高了PCR检测HBV cccDNA的特异性。2．适当浓度的苯巴比妥钠可以促进孕10周龄人胎肝细胞分化成熟，并诱导HBV易感性的出现。以非灌流法分离孕10周龄人胎肝细胞，细胞活力良好；接种后微量蓖麻毒素A亚单位处理能够有效纯化肝实质细胞。以自行设计无血清培养基为基础，建立10种培养条件，发现添加2.5mM苯巴比妥钠在培养10日后，仍可以保持胎肝细胞呈典型多边形形态，在抑制了胚胎特异性基因如甲胎蛋白(AFP)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)表达的同时，促进了成熟肝细胞特异性基因如白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的表达。由此提示苯巴比妥钠可诱导人胎肝细胞向成熟肝细胞表型分化。HBV体外感染实验发现，培养基中添加苯巴比妥钠可诱导孕10周龄人胎肝细胞在培养第6日起出现HBV易感性，并保持至第10日培养结束。其他培养条件及阴性对照、空白对照均不能被HBV成功感染。3．“双重削减”策略鉴别出HBV易感性出现前后基因表达变化。 我们在本研究的最后部分创立了双重削减策略，即实验组内检测相与驱动相之间的抑制性削减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)，以及实验组和背景组之间的对比削减，实验结果发现，此种策略减少了无关新基因对实验结果判断的干扰。 重复苯巴比妥钠诱导实验表明，HBV易感性出现可能与胎肝细胞遗传背景无关；以添加苯巴比妥钠的培养组为实验组，未添加的为背景组；选择易感性出现前的培养第3日为驱动相、易感性出现后的第6日为检测相，同时以SSH检测实验组和背景组的基因变化。通过校验步骤，实验中多个关键环节的结果均符合预期；最终的SSH实验结果显示，“虚拟”对照削减成功显示出预知的条带，且明显减少了驱动相和检测相之间相同基因cDNA的数量。 两组差异基因T/A克隆效率分别为97%和94%，随机挑取96个白色克隆，扩增插入片段后点膜建立4个cDNA阵列膜，分别以4种探针杂交，在背景组中鉴别出3个差异克隆，在实验组中鉴别出7个差异克隆。测序后获得10个不同的人类蛋白质基<WP=9>因，根据既往国内外有关研究结果进行简单筛选，发现其中蛋白酶体酶26s亚单位、血清粘蛋白和D-钙粘蛋白前体最有可能与HBV感染人胎肝细胞有关。 本课题创新点：1． 改良了HBV cccDNA的PCR检测法，明显提高了其特异性。2． 自