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目的研究自噬在敌敌畏(O,O-dimethyl-O-2,2-dichlorovinylphosphate,DDVP)所致神经毒性中的作用与机制,观察DDVP对SK-N-SH细胞氧化损伤作用,研究细胞氧化损伤蛋白的降解去路,探究自噬对损伤蛋白的作用机制以及自噬与泛素蛋白酶体途径、calpain系统在降解氧化损伤蛋白过程中的相互关系。方法1.计数法测定SK-N-SH细胞群体倍增期,DDVP(0、40、60、80、100、120、140μM)作用于SK-N-SH细胞48h,测定半数抑制浓度(IC50)。2.100μM DDVP作用于SK-N-SH细胞(0、24、48h),巴氏染色观察细胞形态改变。以DDVP(0、40、60、80、100、120μM)作用于SK-N-SH细胞48h,酶标仪检测细胞超氧化物歧化酶SOD活性,紫外可见分光光度计检测细胞内过氧化氢酶CAT活性、MDA含量。3.DDVP(0、25、50、100μM)作用于SK-N-SH细胞48h,设定同期Starvation对照,MDC染色,激光共聚焦观察SK-N-SH细胞自噬改变。DDVP(0、25、50、100μM)作用于SK-N-SH细胞48h,Western Blot测定LC3II/I和Beclin1蛋白的表达;自噬PI3K/AKt信号通路VSP34抑制剂3-MA(1.0m M),Calpain抑制剂Calpastatin 500 n M分别预处理SK-N-SH细胞6h和4h后,100μM DDVP染毒48h,DMSO为对照组,提取蛋白,Western Blot测Beclin1、LC3II、LC3I蛋白的表达。4.Verapamil(20μM)、2-APB(100μM)、verapamil(20μM)+2-APB(100μM)预处理细胞,100μM DDVP染毒48h,DMSO为对照组,提取蛋白,Western Blot测Beclin1、LC3II、LC3I;荧光分光光度计测定钙离子信号通道抑制后calpain活性。5.DDVP不同浓度染毒SK-N-SH 48 h后,荧光分光光度计测定26S蛋白酶体T-L、CT-L、PGPH活性。Western Blot测MAP-2、p62蛋白的含量,免疫共沉淀测定MAP-2蛋白上UB蛋白的含量。结果1.SK-N-SH细胞群体倍增期(36.28±1.46)h,DDVP 48小时半数抑制浓度(IC50)为(105.22±5.80)μmol/L。2.DDVP作用SK细胞48小时后,巴氏染色,SK-N-SH细胞未见分化特征;随着DDVP浓度增高,SK-N-SH细胞内丙二醛(MDA)的含量逐渐增高,超氧化物歧化酶(SOD)、CAT活性逐渐降低,呈剂量—效应关系(P<0.05)。3.DDVP对细胞自噬的影响:随着DDVP作用浓度的增加,SK-N-SH细胞自噬泡数量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),Beclin1、LC3-Ⅱ表达相应增加(P<0.05),且这种蛋白表达的增加可以被自噬PI3K/AKt信号通路抑制剂3-MA,以及calpain抑制剂capstatin抑制(P<0.05)。4.Calpain系统相关变化:钙信号通道抑制剂verapamil和2-APB分别和合并预处理SK-N-SH细胞后发现,verapamil可以抑制自噬相关蛋白Beclin1、LC3II、LC3I的表达(P<0.05),而2-APB没有表现出这种抑制作用(P>0.05),相应各处理组DDVP诱导的SK-N-SH细胞calpain活性没有明显改变(P>0.05)。5.泛素蛋白酶体途径相关变化:随着DDVP浓度增高,26S proteasome T-L活性、CT-L活性随着DDVP作用浓度的增加逐渐降低,差异均有统计学意义(P<0.05),PGPH活性变化(P>0.05),无统计学意义,MAP-2、p62表达降低(P<0.05),MAP-2的泛素化标记逐渐增加(P<0.05)。结论1.DDVP对SK-N-SH细胞具有氧化损伤作用。2.DDVP可以增强SK-N-SH细胞自噬水平;PI3K/AKt信号通路,calpain系统参与调节细胞自噬。3.DDVP能造成SK-N-SH细胞MAP-2蛋白的泛素化积聚,细胞内p62的含量降低,泛素化标记的MAP-2可能通过p62介导进入自噬溶酶体途径降解。