目的研究大黄素对胶原诱导性关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)模型大鼠和人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes of rheumatoid arthritis,RA-FLS)肿瘤坏死因子α(Tumor necrosi factor-α,TNF-α)、缺氧诱导因子 1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)以及一氧化氮(Nitric oxide,NO)水平的影响,探讨大黄素通过调控TNF-α-HIF-1α-iNOS-NO信号通路干预RA的分子机理,为针对RA的新药研发和临床用药提供实验依据。方法1.采用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)进行虎杖中大黄素提取与含量测定,然后根据测定结果配制相应浓度大黄素溶液。2.饲养SPF级Wistar雄性大鼠60只,随机分为正常组、模型组、高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性对照组。正常组除外,其余5组前20d建立CIA大鼠模型,然后药物干预20d(高、中、低剂量组分别予4g.L-1大黄素溶液80mg.Kg-1、40mg.Kg-1、20mg.Kg-1;阳性对照组予0.75g.L-1地塞米松溶液7.5mg.kg-1)。每周测定大鼠体重和双后足跖厚度,40d后拍取大鼠足爪图片与X-Ray,并且取大鼠肝脏、脾脏、膝关节滑膜以及血清。采用HE染色法观测大鼠膝关节滑膜组织及肝、脾组织形态病理学改变;采用免疫组化染色法检测大鼠膝关节滑膜组织中TNF-α、HIF-1α以及 iNOS 表达变化;采用酶联免疫(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法和硝酸还原酶法检测大鼠血清中TNF-α、HIF-1α、iNOS及NO表达变化;采用蛋白印迹(Western blot)法检测大鼠脾组织中TNF-α、HIF-1α以及iNOS表达变化;采用逆转录一聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测大鼠脾脏中 TNF-α、HIF-1α以及 iNOS mRNA 基因表达水平。3.培养来源于人的RA-FLS与正常-FLS,设立正常组、模型组、高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性对照组。正常组用正常-FLS,其余5组用RA-FLS。高、中、低剂量组分别给予80μmol.L-1、40μmol.L-1及20μmol.L-1的大黄素溶液。阳性对照组给予0.1mg.L-1地塞米松溶液。药物干预时间均设置24h、48h、72h、96h 4个时间段。用甲苯胺蓝染色法和HE染色法观测滑膜细胞的生长和形态学改变;用ELISA法与硝酸还原酶法检测滑膜细胞培养液中TNF-αa HIF-1α、iNOS及NO表达变化;用Western blot法检测滑膜细胞中TNF-α、HIF-1α以及iNOS表达水平。结果1.采用HPLC法测得虎杖中大黄素成分的得率是1.00%。2.(1)造模后大鼠逐渐出现倦怠、脱毛、腹泻、跛行、双后足爪红肿、畸形以及溶骨等现象,第20d上述病变症状表现最为严重,模型组体重较之正常组明显降低(P<0.05),模型组足跖肿胀度较之正常组明显增加(p<0.05)。药物干预20d后大鼠上述病变症状得以改善,与模型组比较,各给药组大鼠足跖肿胀度逐渐下降,尤其是中剂量组(P<0.05)。(2)HE染色结果显示:正常组大鼠肝、脾以及膝关节滑膜组织形态未见异常。模型组滑膜细胞结构破坏,炎性细胞大量浸润,血管明显增生;脾脏红白髓明显增生,结构模糊,肉芽肿形成;肝脏细胞结构破坏,胞浆着色深重,胞核大幅度增多且分布紊乱。药物干预20d后,各给药组上述病变情况均有缓解,尤其是中剂量组。其中滑膜组织炎性细胞浸润与血管新生均被抑制;脾脏红白髓增生和肉芽肿生成减少,结构清晰度增加;肝脏结构清晰度增加,胞浆着色变浅,胞核大幅度减少且分布均匀。(3)免疫组化染色检测、ELISA检测、硝酸还原酶法检测、Western blot检测以及RT-PCR检测结果显示:模型组大鼠血清、脾及滑膜组织中TNF-α、HIF-1α、iNOS蛋白与mRNA以及NO水平均明显高于正常组(P<0.05)。药物干预20d后,大黄素组和地塞米松组TNF-α、HIF-1α、iNOS蛋白与mRNA以及NO水平较之模型组均减少(P<0.05)。其中,膝关节滑膜组织中TNF-α、HIF-1α及iNOS蛋白均表现为中剂量组下降最多(P<0.05);血清中TNF-α蛋白表达为地塞米松组下降最多,低剂量组次之(P<0.05),而HIF-1α、iNOS及NO均表现为中剂量组下降最多(P<0.05);脾脏中TNF-α、HIF-1α及iNOS mRNA基因表达均表现为中剂量组下降最多(P<0.05)。HIF-1α蛋白表现为中剂量组下降最多(P<0.05),而TNF-α与iNOS蛋白表现为高剂量组下降最多(P<0.05)。3.(1)人滑膜细胞甲苯胺蓝和HE染色显示:以梭形为主的滑膜细胞均贴壁生长,卵圆形胞核居于细胞中央,RA-FLS明显比正常-FLS增长迅速。(2)ELISA与硝酸还原酶法检测结果显示:RA-FLS细胞培养液中TNF-α、HIF-1α、iNOS以及NO表达在24h、48h、72h、96h均明显高于正常组(P<0.05),不同浓度大黄素不同时间段给药后TNF-α、HIF-1α、iNOS以及NO表达均有降低,尤其是给药80μmol.L-1,干预96h下降最多(P<0.05)。(3)Western blot检测结果显示:药物干预96h后,大黄素组和地塞米松组RA-FLS细胞中TNF-α、HIF-1α及iNOS蛋白表达较之模型组均有减少,其中高剂量组下降幅度最大,低剂量组下降幅度最小,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.随着关节炎病情发展,CIA大鼠血清、脾脏以及膝关节滑膜组织中TNF-α、HIF-1α、iNOS蛋白与mRNA以及NO水平显著升高。大黄素可以抑制CIA大鼠血清、脾脏及膝关节滑膜组织中TNF-α、HIF-1α、iNOS蛋白与mRNA以及NO水平,并且大黄素给药剂量为40mg.kg-1时下调作用最显著,控制炎症反应,减少骨与软骨损伤,阻碍血管增生,改善CIA大鼠病变症状。2.随着关节炎病情发展,人RA-FLS中TNF-α、HIF-1α、iNOS以及NO表达会逐渐增加,尤其在细胞培养96h增加最多。大黄素可以剂量依赖性下调人RA-FLS中TNF-α、HIF-1α、iNOS以及NO表达,并且在给药80μmol·L-1,干预96h下调作用最显著。3.大黄素可以抑制TNF-α-HIF-1α-iNOS-NO信号通路开放,下调相关细胞和组织中TNF-α、HIF-1α、iNOS蛋白与mRNA以及NO水平,控制炎性发展,降低骨与软骨关节损伤,减少新生血管形成,发挥治疗RA的作用。