【摘 要】
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目的构建针对人甲基化结合蛋白MeCP2(methyl-CpG-binding protein 2)的真核表达质粒,并稳定转染人肺腺癌细胞A-549,挑取稳定表达的细胞单克隆,进一步研究MeCP2蛋白表达的下降
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目的构建针对人甲基化结合蛋白MeCP2(methyl-CpG-binding protein 2)的真核表达质粒,并稳定转染人肺腺癌细胞A-549,挑取稳定表达的细胞单克隆,进一步研究MeCP2蛋白表达的下降对肺腺癌细胞A-549增殖和凋亡的影响。方法在Pubmed中查找MeCP2的mRNA序列,利用ambion网上软件选取两个靶序列并设计两个shRNA(small hairpin RNA),体外化学合成的单链退火为shRNA,运用T4DNA连接酶连接到pSilencer-2.1-U6载体上,经PCR、测序鉴定正确后,稳定转染A-549细胞,在mRNA和蛋白水平观察两个重组质粒对MeCP2的干扰作用,流式细胞仪和MTT检测其对细胞凋亡和生长的影响。结果成功构建两个针对MeCP2不同靶序列的shRNA真核表达质粒,分别命名为pSilencer-2.1-shRNA1和pSilencer-2.1-shRNA2;两质粒稳定转染了人肺腺癌细胞A-549,且证明两质粒在mRNA和蛋白水平可以明显使MeCP2表达下调;稳定转染两质粒的肺腺癌细胞A-549凋亡比例增加,增殖速度减慢。结论RNA干扰下调MeCP2表达可以明显促进人肺腺癌细胞A-549的凋亡并抑制A-549细胞增殖。
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