链霉菌(Streptomyces)能够合成大量次级代谢产物,是天然产物药物开发的最重要来源之一。但是,链霉菌因其特殊的分枝状菌丝结构、基因组的高G+C水平以及线性基因组的不稳定性,其遗传操作要比其它模式细菌困难许多,这成为了对其进行基因功能研究和代谢工程改造的重要瓶颈。目前的CRISPR/Cas系统通过在基因组上引入DNA双链断裂(DSB)的方式加速了同源双交换突变株的筛选过程,但在实际应用中,这种方法由于极高的致死率而常常难以得到接合转移子。同时,链霉菌对DSB的低修复效率也限制了该技术在多靶点同时编辑时的应用。因此,亟需更加快速高效且安全稳定的基因编辑方法。最近报导的基于CRISPR/Cas系统开发的单碱基编辑(base editing,BE)技术为基因编辑翻开了新的篇章。通过将单链DNA特异性的胞嘧啶脱氨酶与失活的Cas蛋白融合形成的胞嘧啶单碱基编辑器(CBE)或将腺嘌呤脱氨酶与失活的Cas蛋白融合形成的腺嘌呤单碱基编辑器(ABE),BE技术可实现由sgRNA介导的靶向C-to-T或A-to-G碱基编辑。BE技术因其不基于DSB和同源重组的独特机制以及系统的简洁和编辑的高效,迅速在各种模式生物中得到应用。基于此,本研究发展了一套基于BE技术的链霉菌高效基因编辑工具。通过使用失活型Cas9引导的单碱基编辑器(BE2和ABEd)实现了效率约为50%的基因编辑,并通过使用缺刻型Cas9引导的单碱基编辑器(BE3和ABEn)实现了效率达100%的基因编辑。此外,本研究通过同时敲除9个靶基因证明了BE3强大的多基因编辑能力,并通过使用高保真版本的BE3(HF-BE3)降低了脱靶编辑。这种新技术摆脱了使用传统同源重组方法进行编辑时耗时费力的突变体筛选过程。更重要的是,该技术首次实现了被人们期望已久的多基因同时靶向编辑。可以预期,本论文发展的基因编辑技术将加速在链霉菌等放线菌中的生物合成途径的体内功能分析以及对有工业价值的天然产物产生菌的遗传改造。