研究背景：糖尿病是人类健康与生命安全的一大威胁,其发病率近几年来呈不断上升趋势,预计中国糖尿病人数到2025年将达3760万,跃居世界第一。1型糖尿病与自身免疫相关,通过免疫反应破坏胰岛β细胞,导致胰岛素分泌不足,对外源性胰岛素依赖严重,常出现严重的并发症。尽管丰富便捷的胰岛素制剂为1型糖尿病患者的血糖控制提供了很大帮助,但仍然面临着胰岛素抵抗和致死性低血糖的风险,同时对血糖的调控缺乏及时性和精确性。胰岛移植重建内源性血糖调控系统是克服上述缺点彻底治愈1型糖尿病的理想方案。免疫损伤以及缺血缺氧等引起的移植物原发性无功能是目前胰岛移植所面临的最大障碍。本研究的目的是寻找一种保护移植胰岛,降低移植物原发性无功能的方法,以提高移植的成功率。骨髓间充质干细胞是一类多能干细胞,它具有无限增殖、多向分化的能力。组织工程学上常用它作为修补缺损、弥补功能的种子细胞。它是造血微环境的重要组成部分,能够强烈地刺激造血,促进血管新生。同时它能合成多种活性细胞因子,通过旁分泌作用于其它细胞,保护目的细胞。并且在低氧环境的刺激下,其增殖、分化和分泌功能都有不同程度的增强。我们的研究设想通过原代分离得到骨髓间充质干细胞,利用低氧刺激增强骨髓间充质干细胞的活性,与原代分离得到的胰岛于体外辅助培养、体内联合移植,以探讨其作为胰岛移植的辅助支持细胞的有效性和可行性。为克服移植物原发性无功能和供体紧缺的困难提供一定的理论依据。第1章：小鼠骨髓间充质干细胞的分离、纯化、培养及鉴定目的：建立小鼠骨髓间充质干细胞体外分离、纯化及培养的方法,并鉴定其生物学特性。方法：通过全骨髓贴壁法得到含杂细胞的骨髓间充质干细胞后,通过特殊培养基选择性优势生长后纯化骨髓间充质干细胞；通过MTT法建立其生长曲线；通过流式鉴定其表面CD标志；并通过特殊成脂肪分化培养基鉴定其分化能力。结果：大部分细胞于24h内贴壁,传代3代以上后形态趋于一致,呈成纤维细胞样。细胞大致4天为一个生长高峰,第3代子细胞和第6代子代细胞在生长速度上有差异。子1代小鼠骨髓间充质干细胞表面CD29和CD71阳性,CD34阴性,CD45弱阳性,CD90阴性。传代后,CD29和CD71阳性率显著上升,CD34仍然阴性,CD45阳性率逐渐减弱。经特殊培养基诱导3周后细胞变圆,出现空泡,内出现脂滴,油红染色呈亮红色。第2章：低氧环境对骨髓间充质干细胞的影响目的：比较小鼠骨髓间充质干细胞体外缺氧培养和正常氧浓度培养的差异。方法：通过全骨髓贴壁法、特殊培养基筛选法得到相同供体来源的骨髓间充质干细胞后,分别培养于20%02和5%O2的环境中；通过细胞计数法建立不同环境下的生长曲线；通过流式鉴定不同条件培养之下的细胞表面标志；并通过特殊成脂肪分化培养基鉴定不同培养条件下的细胞分化能力；RT-qPCR和ELISA分别从基因水平和分泌蛋白水平检测两者VEGF、IL-6、MCP-1和MMP-9的表达差异。结果：低氧环境中大部分细胞于24h内贴壁,通过2次传代后形态基本趋于一致,呈成纤维细胞样。低氧培养的细胞生长速度明显优于正常培养的细胞。低氧培养的骨髓间充质干细胞表面CD29和CD71阳性,CD34阴性,CD45弱阳性,CD90阴性,与正常培养的细胞类似。低氧刺激后的细胞经特殊培养基诱导后亦变圆,出现空泡,内出现脂滴,油红染色呈亮红色。基因水平上低氧培养的细胞VEGF、IL-6、MCP-1和MMP-9的表达都明显高于正常状态下的细胞,分泌蛋白水平上低氧培养的细胞VEGF明显要高得多,IL-6略高,MCP-1和MMP-9反而低。第3章：小鼠骨髓间充质干细胞体外对活体胰岛的保护作用目的：探讨小鼠骨髓间充质干细胞体外对胰岛的保护作用。方法：分离得到相同供体来源的骨髓间充质干细胞后,代替以胰岛培养基,分别培养于20%O2和5%O2的环境中48h,制备条件培养基；通过Ⅳ型胶原酶消化法结合密度梯度离心法分离纯化小鼠胰岛；用普通培养基和条件培养基分别在20%O2和1%O2的环境中培养胰岛,AO/PI染色鉴定其凋亡情况,打散胰岛细胞团用流式检测其死亡率；前后用不同浓度的葡萄糖刺激所获得的胰岛,并通过放免方法检测不同培养基在不同的氧浓度条件下培养的胰岛的胰岛素释放能力。结果：Ⅳ胶原酶消化加密度梯度离心后在20%和23%Ficoll界面层获得胰岛,纯度在85%以上,活力良好。条件培养基尤其是低氧培养BM-MSCs获得的条件培养基培养胰岛后,AO／PI染色显示胰岛在低氧环境中耐受良好,形态完整,凋亡细胞少,流式检测死亡率低,整体明显优于普通培养基培养的胰岛。条件培养基尤其是低氧培养BM-MSCs获得的条件培养基培养的胰岛,在前后不同葡萄糖浓度的刺激下,其胰岛素释放量要明显高于普通培养基培养的胰岛。第4章：小鼠骨髓间充质干细胞与活体胰岛联合移植研究目的：探讨小鼠骨髓间充质干细胞体内对胰岛的保护作用。方法：STZ腹腔注射诱导糖尿病模型建立；分离得到的胰岛按不同剂量(250、300、350和400 IEQ)分别移植于小鼠肾包膜下,于移植后30天内定期观察受体鼠体重、非禁食血糖和禁食后血糖的变化；相同供体来源的骨髓间充质干细胞分别培养于20%O2和5%O2的环境中48h后,各自按1×10~6的数量与250或300 IEQ胰岛联合移植于肾包膜下,移植后1月内,定期观察各组体重、非禁食血糖和禁食后血糖变化；各实验组受体鼠在观察期结束之后,用10%葡萄糖灌胃行口服糖耐量实验。结果：STZ腹腔注射成模率在70%作用。400 IEQ能使糖尿病小鼠血糖10天完全降到正常,之后一直稳定在正常水平。250、300和350 IEQ都有一定的降血糖作用,但血糖水平无法到达正常。低氧培养的骨髓间充质干细胞和250 IEQ联合移植可以达到400 IEQ单独移植的效果。正常培养的骨髓间充质干细胞和300 IEQ联合移植亦可达到400 IEQ单独移植的效果。低氧培养的骨髓间充质干细胞和250 IEQ联合移植、正常培养的骨髓间充质干细胞和300 IEQ联合移植后的受体鼠糖耐量完全趋于正常。全文结论：1、全骨髓贴壁法结合特殊培养基选择性培养可以获得高纯度的小鼠骨髓间充质干细胞。2、所获得的小鼠骨髓间充质干细胞完全具备其相应的生物学特性。3、低氧培养的小鼠骨髓间充质干细胞亦完全具备相应的生物学特性,但在增殖速度和VEGF的表达上要明显优于正常氧浓度培养的细胞。4、IV胶原酶消化加密度梯度离心法可以获得高纯度的小鼠胰岛。5、骨髓间充质干细胞尤其是低氧培养的细胞在体外对小鼠胰岛有保护作用,它通过旁分泌途径增强胰岛抗凋亡以及胰岛素释放能力。6、骨髓间充质干细胞尤其是低氧培养的细胞与胰岛共移植后能显著降低糖尿病小鼠的血糖水平,稳定控制在正常范围,改善糖尿病症状。7、骨髓间充质干细胞尤其是低氧培养细胞的联合移植可以显著降低移植胰岛的用量,减小供受体比,缓解供体紧缺。