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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起,也叫猪蓝耳病,其特征主要是引起早产,流产,死胎等生殖障碍,以及仔猪和育肥猪严重呼吸道疾病的发生,是烈性病毒性传染病。自中国首次报道该病以来,该病在中国已流行并发展了 20多年,尤其是2006年中国高致病性蓝耳病(HP-PRRS)的暴发,给养猪业带来巨大的经济损失。自2008年以来,中国13个地区出现了类NADC30毒株,这些毒株与2008年从美国分离出的NADC30变异株具有相同的缺失特征,与国内流行毒株发生重组,而且重组类型复杂多样。PRRSV高度易发生变异,导致遗传多样性显著,且疫苗的发展跟不上变异的速度,给PRRS流行的防控带来很大困难。本研究旨在对山东省PRRSV流行株感染情况调查。病毒分离和鉴定,全基因组序列测定,重组分析和遗传进化分析,构建多重TaqMan实时荧光定量PCR方法能同时鉴定美洲型PRRSV经典型毒株,高致病力毒株和新型类NADC30株的。了解山东省PRRSV感染情况,为山东省PRRS综合防治工作提供参考。1.山东猪繁殖与呼吸综合征病毒感染情况调查,2014-2017收集2014年6月至2017年4月山东省13个猪场的347份临床疑似病料,采用RT-PCR方法对PRRSV检测。结果:243例阳性,全部测序。其中类NADC30株在PRRSV中占50.62%,经典毒占6.67%,高致病毒株HP-PRRSV占42.80%,说明NADC30毒株已成为山东流行毒株。2.PRRSV毒株的分离与鉴定为了解山东省PRRSV流行情况,将PRRSV阳性试验材料接种Marc-145细胞系或原代PAM细胞中。盲传三代后,RT-PCR检测和间接免疫荧光鉴定病毒试验。本次试验成功分离到3个新变异毒株,为进一步研究PRRSV的致病力和遗传进化奠定了基础。3.三个PRRSV分离株的全基因组测序与重组演化分析为了进一步了解三种分离株SDhz1512、SDlz1601和SDYG1606的遗传变异,基于在GenBank上公布的代表性毒株的全基因组序列设计了 12对引物。全基因组扩增、测序、组装和序列比对,使用生物软件进行重组分析,利用RaxML及BEAST生物信息学软件进行遗传演化分析。结果显示:山东分离株与NADC30的亲缘关系相对较近,但也有很大差异,是新变异毒株。山东省流行株可能存在经典毒株,HP-PRRSV株或NADC30株之间的重组。这表明新的突变毒株不仅重组,而且重组变得越来越多样化。4.多重TaqMan实时荧光PCR检测方法鉴定经典PRRSV株,高致病性变异株和类NADC30毒株及其临床应用为建立猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV)的快速诊断方法,使Nsp2为靶基因分别设计经典型、高致病变异株和类NADC303种类型的PRRSV特异引物及特异探针,以ORF7为靶基因设计美洲型通用引物和通用探针,通过对荧光PCR反应条件和反应体系的优化,建立多重实时荧光PCR方法。该方法特异性强,灵敏度高,检出限为10个病毒拷贝。利用多重实时荧光PCR检测方法对临床样本检测,与测序结果比较结果均一致,表明该方法准确性好,尤其针对不同PRRSV毒株混合感染的样本,相比PCR测序法,优点更为突出,省时,闭管操作,无污染。本方法的建立为PRRSV的快速鉴别及流行病学调查提供了有效的技术手段。