研究背景心肌肥厚（myocardial hypertrophy）是心脏在容量负荷及压力负荷增加时的代偿性反应,可减少室壁张力与心肌氧耗,是维持心脏功能正常的重要机制,也是诸多心血管疾病发生、发展的共同病理过程^[1]。研究证实,病理性心肌肥厚是缺血性心脏病、心律失常和心力衰竭的重要危险因素^[2],常导致了心原性休克和猝死等严重临床事件。然而经过长期的探索目前仍然未能有效控制和解决病理性心肌肥厚的临床问题,因此,探索该病的独特机制,寻找新药靶点具有重要的医学价值和社会意义。在众多的心肌肥厚影响因素中,机械应力是多种信号分子之一可触发由机械分子引起的细胞肥大反应。2006年海涅克和同事们发现,Z-disc及其相关蛋白可以驱动机械应力刺激信号转导,这一过程也被称为“机械转导”^[3]。钙调神经磷酸酶作为一个众所周知的Z-disc蛋白簇,被证明可以连接心脏骨架直接调节基因转录的元件^[4,5]。此外,许多分子信号如胰岛素样生长因子-1（IGF-1）,转化生长因子（TGF-β）、血管紧张素Ⅱ和内皮素-1由不同的细胞受体介导可能产生不同的信号级联,最终导致心肌细胞水平的转录水平改变和肥大发生^[6-8]。更重要的是,炎症信号通路氧化应激在心肌肥厚发病机制中也起到重要作用^[9,10]。长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,lncRNAs）是一类超过200nt长度的RNA核苷酸大部分没有编码蛋白质的能力。虽然lncRNA不编码蛋白质,但是它们还能像信号分子或“海绵”一样通过结合调节基因表达生成序列特异性RNA^[11]。近年来,越来越多的证据表明多种lncRNAs,如Chaer、Chast、Mhrt、CHRF、H19、MIAT、Tincr在心肌肥厚的发生中的起重要作用^{[12-14][15-17]}。在这些lncRNA中,TINCR曾报道通过直接绑定到PRC2引起表观遗传学改变而调控CaMKⅡ的表达从而减轻心肌肥厚^[17]。然而目前尚不清楚Tincr在心肌肥厚中是否有其他靶点和机制。因此,本研究采用压力超负荷小鼠心肌肥厚模型,观察Tincr在心肌肥厚中的表达,证实过表达Tincr可减轻TAC诱导的心肌肥厚;利用H9c2心肌细胞培养技术,探寻Tincr新的可能的直接靶点,探讨Tincr改善心肌肥厚的新的信号通路机制,为今后研发药物干预心肌肥厚提供重要的依据。第一部分长链非编码RNA Tincr抑制压力负荷诱导的心肌肥厚目的:观察Tincr在胸主动脉缩窄所致的心肌肥厚的心肌组织中表达的变化;证实Tincr在小鼠体内具有改善心肌肥厚的作用。方法:把C57bl/6 J雄性成年小鼠按随机编号,分为假手术组（Sham组）和胸主动脉缩窄模型组（TAC组）,过表达Tincr+TAC组,过表达空病毒载体+TAC组。采用AAV9技术过表达Tincr,在TAC术前2周通过尾静脉注射过表达Tincr或阴性对照,在TAC造模后的6w检测左室心肌组织中Tincr、ANP、BNP、β-MHC指标的表达。（1）观察比较四组存活、饮食、饮水、精神等情况;（2）RT-qPCR检测各组心肌组织中Tincr的表达变化;（3）H&E染色及马松染色检测各组心肌组织病理形态学改变;（4）超声心动图检测各组小鼠心脏功能的变化;（5）RT-qPCR和Western Blot检测各组ANP、BNP、β-MHC在心肌组织中表达的变化。结果:（1）与对照组相比,TAC模型组心肌明显增厚,心脏/体重比明显增加、心肌细胞面积明显增加,差异有统计学意义;Tincr的mRNA表达明显降低;小鼠心肌组织中ANP、BNP、β-MHC的mRNA和蛋白表达明显升高。（2）与空载病毒+TAC组比,Tincr过表达+TAC组的Tincr的mRNA水平明显升高,心肌细胞面积明显减少,心重与体重比降低;ANP、BNP、β-MHC的mRNA和蛋白水平明显降低,差异有统计学意义。（3）TAC术后6周心脏彩超提示,四组小鼠的LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd、EF存在明显差异,TAC模型组较假手术组的LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd明显升高,而EF明显降低;Tincr过表达组与空载病毒组LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd明显降低,而EF有所升高。（4）H&E染色及马松染色提示:TAC组小鼠心肌组织心肌细胞面积较Sham组明显扩大,并有少许纤维化;Tincr过表达+TAC组较空载病毒+TAC组心肌细胞面积明显减小,但纤维化无明显统计差异。结论:（1）通过胸主动脉缩窄的压力负荷建立小鼠心肌肥厚模型,TAC组存在明显病理性心肌肥厚,Tincr的mRNA水平明显降低;（2）过表达Tincr可减轻TAC所导致的病理性心肌肥厚的程度,改善肥厚心肌的功能,并减少ANP、BNP、β-MHC的蛋白表达。Tincr为心肌肥厚过程中可干预的靶点,但Tincr减轻心肌肥厚的机制需要阐明。第二部分Tincr通过miR-31-5p减轻压力负荷导致的心肌肥厚效果目的:发现并明确Tincr的下游靶点,进一步讨论Tincr在心肌细胞肥厚过程中的作用。方法:（1）培养H9c2细胞经AngⅡ处理后观察Tincr和心肌细胞的变化,检测ANP、BNP、β-MHC的mRNA和蛋白表达。（2）通过Starbase数据库生物信息学预测发现lnc RNA-Tincr可能与miR-31-5p以及miR-544存在结合,双荧光素酶实验证实miR-31-5p及miR-544是Tincr的直接靶点。按照0ug、2ug、5ug、10ug过表达pc DNA-Tincr转染H9c2心肌细胞后进行RT-q PCR实验观察miR-31-5p和miR-544的mRNA表达。（3）通过RT-q PCR检测第一部分小鼠压力负荷模型的四组中miR-31-5p和miR-544的mRNA表达。（4）生物信息学分析、荧光素酶实验检测miR-31-5p的下游可能靶点PKCε。（5）培养H9c2细胞经AngⅡ处理后,过表达Tincr通过免疫荧光观察心肌细胞面积变化,RT-q PCR观察PKCε的mRNA表达。结果:（1）在AngⅡ处理的H9c2细胞系中,与盐水对照组相比,心肌细胞出现肥大,ANP、BNP、β-MHC的mRNA和蛋白表达升高;Tincr的mRNA表达水平减少;（2）双荧光素酶实验证实miR-544与lnc RNA-Tincr在H9c2心肌细胞存在结合,miR-31-5p与lnc RNA-Tincr在H9c2心肌细胞中也存在结合,而突变后的miR-544及miR-31-5p酶活性与细胞载体所显示酶活性无明显差异;在给予Tincr过表达的H9c2心肌细胞中分别抑制miR-31-5p和miR-544的mRNA表达并呈剂量依赖性,随Tincr剂量升高,miR-31-5p与miR-544呈浓度依赖性下降。（3）在压力负荷诱导的心肌肥厚小鼠模型中,仅有miR-31-5p的mRNA表达升高,而miR-544并未发生变化。（4）生物信息学分析miR-31-5p的可能靶点为PKCε;双荧光素酶实验显示与miR-NC组相比,WT组荧光素酶活性显著下降,而mut-PKCε组荧光素酶活性无差异。（5）AngⅡ处理后,心肌细胞面积较对照组增加,过表达Tincr较对照载体心肌细胞面积减少;AngⅡ处理后PKCε的mRNA水平较对照组减少,过表达Tincr上调PKCε的mRNA水平。结论:（1）在活体模型或细胞模型中证实miR-31-5p都是Tincr的直接靶点;（2）Tincr可能通过抑制miR-31-5p影响PKCε表达发挥抑制心肌肥大的作用;（3）miR-31-5p的可能靶点为PKCε。第三部分Tincr减轻心肌细胞肥大的信号转导通路的研究目的:进一步探讨Tincr是否通过miR-31-5p发挥抑制心肌肥厚的作用,阐明Tincr改善心肌肥厚的信号通路。方法:（1）培养H9c2心肌细胞,通过RT-q PCR和western blot实验检测经过miR-31-5p-mimic作用后PKCε的表达。（2）采用lnc RNA Tincr过表达质粒转染,并分别共转染miR-31-5p/miR-544 inhibitor,观察他们对PKCε的mRNA和蛋白表达的作用。（3）采用慢病毒干扰lnc RNA Tincr或分别给予sh-Tincr+miR-31-5p抑制剂或给予shTincr+PKCε过表达后观察心肌细胞面积,miR-31-5p以及PKCε的mRNA表达,免疫印迹法检测PKCε的蛋白表达以及ANP、BNP、β-MHC的蛋白表达。（4）免疫印迹法以及免疫组化法在小鼠心肌中验证过表达Tincr对miR-31-5p及PKCε的作用。结果:（1）在H9c2心肌细胞中,过表达miR-31-5p抑制PKCε的mRNA表达和蛋白表达呈浓度依赖性。（2）在H9c2心肌细胞中分别抑制miR-31-5p或miR-544后发现miR-31-5p抑制剂组PKCε的mRNA表达升高有统计学意义,同时给予过表达Tincr后,抑制miR-31-5p+过表达Tincr组较单纯抑制miR-31-5p组PKCε的mRNA及蛋白表达差别无统计学意义,而过表达Tincr+miR-544抑制剂组较单纯给予miR-544抑制剂组PKCε的mRNA及蛋白表达差别有统计学意义,但较单纯给予Tincr组无明显差异。（3）干扰Tincr引起H9c2心肌细胞面积增大,抑制miR-31-5p或过表达PKCε均可抑制心肌细胞肥大效应;干扰Tincr可使miR-31-5p的mRNA水平升高;当Tincr被抑制和或miR-31-5p被抑制后,PKCε的mRNA和蛋白表达升高;干扰Tincr可使H9c2心肌细胞中ANP、BNP、β-MHC的蛋白表达升高,同时干扰Tincr和miR-31-5p的抑制剂或给予干扰Tincr+过表达PKCε可使ANP、BNP、β-MHC的蛋白表达下调。（4）过表达Tincr的小鼠心肌肥厚模型中对miR-31-5p抑制作用加强,从而上调PKCε的蛋白表达。结论:（1）抑制miR-31-5p的表达而不是miR-544才能阻断Tincr对PKCε表达的调控,PKCε位于miR-31-5p的下游;（2）抑制miR-31-5p或过表达PKCε则可以逆转Tincr干扰后引起的心肌细胞肥大效应;（3）Tincr通过下调miR-31-5p促进PKCε的mRNA和蛋白表达。