论文部分内容阅读
随着畜禽养殖业抗生素的大量使用,畜禽粪便已成为抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes,ARGs）的汇集热点。同时,我国作为动物养殖大国,畜禽粪便常常不经过处理或者处理不完善而直接施用于农田土壤中,这增加了土壤被抗生素和ARGs污染的风险。粪肥的施用会向土壤中引入抗生素和ARGs,增加土壤中ARGs的丰度和多样性。土壤是微生物的栖息地,同时是抗生素和ARGs的天然储藏地,由于抗生素的选择压力、ARGs的外源输入以及抗性基因的水平转移,使得土壤中越来越多的微生物对不同的抗生素表现出耐药性。施用不同肥料的土壤中的细菌群落和ARGs存在明显的差异。本研究主要围绕着祁阳红壤试验站不同施肥措施下土壤中ARGs多样性、ARGs的宿主以及施猪粪土壤中不同耐药菌内ARGs的多样性和其基因环境进行研究。本研究采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）比较了祁阳红壤试验站长期施用畜禽粪便（农家猪粪）、化学肥料（NPK）和不施肥对照的土壤中ARGs的差异。实验对土壤DNA样品中16S rRNA基因、五种ARGs（tetG、tetW、aadA、sul2和qacEdelta1）和三种MGEs（Mobile gene elements）指示基因（intI1、tnpA04和IncW）的绝对丰度进行了定量分析,并结合土壤细菌群落组成采用相关性分析对ARGs的宿主进行了初步推测。结果表明,与对照相比施用NPK对所测定的基因的丰度无显著影响（p>0.05）,而施用猪粪显著增加测定基因的丰度（p<0.05）。基因aadA、sul2、qacEdelta1和tnpA-04这四个基因的潜在宿主OTU（Operational taxonomic unit）主要分布于Alphaproteobacteria、Deltaproteobacteria 和 Actinobacteria。本研究 ARGs 和 MGEs 的潜在宿主进行了推测时并没有考虑ARGs和MGEs分布于质粒等可在不同的细菌之间传播的移动元件上的可能性。所以对ARGs和MGEs潜在宿主的预测还有待进行下一步研究。因此,本研究通过培养祁阳红壤试验站长期施用猪粪的土壤中的抗性细菌以及细菌基因组测序分析了不同抗性细菌中ARGs的分布情况及其基因环境。结果表明:从施用猪粪土壤中共分离36株抗性细菌（9株头孢氨苄、3株金霉素、9株链霉素、5株氧氟沙星、4株磺胺二甲氧嘧啶和6株氯霉素抗性细菌）,隶属于变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门,其中变形菌门和厚壁菌门抗性细菌占主要优势。本实验挑选了 18株抗性细菌进行了基因组测序。本研究在由不同抗生素筛选到的抗性细菌中检测到针对相应抗生素的专性抗性基因以及产生抗性的基因点位突变。其中由头孢氨苄、金霉素和氯霉素筛选到的抗性细菌中均存在相似性较高的专性抗性基因;由磺胺二甲氧嘧啶筛选到的两株菌中,菌株SUL1中存在专性的磺胺类抗性基因sul2,而菌株SUL3中仅检测出基因folP发生了可导致磺胺类抗性的点位突变;由链霉素筛选到的三株抗性细菌中均发现了可导致抗性的基因rpsL点位突变;由氧氟沙星筛选到的菌株中未检测到针对喹诺酮类抗生素的专性抗性基因以及点位突变,该菌株的抗性可能由广谱的抗生素外排机制导致。除了针对筛选抗生素的抗性基因,抗性细菌中普遍还存在针对非筛选抗生素的专性抗性基因,并且这些抗性基因还与已知抗性基因具有较高的相似性。其中,β-内酰胺类抗性基因在所有抗性细菌中分布最为广泛,其次为四环素类和氯霉素抗性基因。这说明施猪粪土壤中抗性细菌可能有被多种抗生素筛选的历史。有7株抗性细菌携带有容易发生水平转移的ARGs,分别是:C17（Pseudomonas sp.）中检测到氯霉素类抗性基因cat7与转座酶相邻;在SUL1（Acinetobactersp.）中检测到四环素类抗性基因tet（Y）与整合酶基因相邻、磺胺类抗性基因su12与转座酶基因相邻,同时发现四环素类抗性基因（tet（Y）、tet（39）、tetR）、磺胺类抗性基因sul2和氯霉素抗性基因floR由质粒携带;在SUL3（Klebsiella sp.）中检测到β-内酰胺酶抗性基因blaCMY-108与整合酶基因相邻;在Str1（Sphingomonas sp.）中检测到β-内酰胺酶抗性基因rm3与整合酶基因相邻;在Cep5（Bacillus sp.）中检测到β-内酰胺酶抗性基因bla1（1）、bla1（4）由同一个质粒携带且均与转座酶基因相邻,同时bla1（1）和bla1（4）还位于不同的基因岛上。检测到氨基糖苷类抗性基因ant（2"）-Ia由质粒携带;在CTC1（Bacillus sp.）中检测到2个四环素类抗性基因tet（L）由质粒携带同时这2个基因相邻。在Cep4（Chryseobacterium sp.）中检测到β-内酰胺酶抗性基因blaCGB与整合酶基因相邻;本研究对不同施肥条件下土壤ARGs进行了定量及ARGs的宿主推测,并对施猪粪土壤中不同的抗生素耐药菌进行了 ARGs多样性和基因环境分析。研究结果显示施用猪粪可显著增加土壤ARGs的丰度和多样性。施猪粪土壤中不同的抗性细菌ARGs多样性及其基因环境存在着明显的差异。ARGs总体的抗性机制表现出一定的宿主种属差异;不同类别抗生素的专性ARGs在土壤抗性细菌中具有不同程度的分布,其中β-内酰胺类抗性基因分布最广,其次为四环素类和氯霉素抗性基因。本研究结果可为预防和缓解土壤ARGs污染提供重要的理论依据。